一种基于双功能识别发夹探针的荧光生物传感器及其特异性检测环状RNA的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于双功能识别发夹探针的荧光生物传感器及其特异性检测环状RNA的方法，本发明专利技术的一种基于双功能识别发夹探针的荧光生物传感器，包括双功能识别发夹探针ih和HCR所需的探针H1和探针H2，所述的探针ih的基因序列为SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，H1的基因序列为SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，所述的探针H2的基因序列为SEQ ID No.5所示的核苷酸序列。本发明专利技术的ihHCR方法不仅提高了circRNA检测的特异性，避免了同源线性RNA的干扰，也保留了HCR的高信号扩增能力，它有实际应用前景揭示circRNA在不同样本的差异表达，从而引导circRNA相关疾病的研究。而引导circRNA相关疾病的研究。而引导circRNA相关疾病的研究。

【技术实现步骤摘要】
一种基于双功能识别发夹探针的荧光生物传感器及其特异性检测环状RNA的方法


[0001]本专利技术涉及生物标志物
，具体涉及一种基于双功能识别发夹探针及杂交链式反应(HCR)的荧光生物传感器及其特异性检测环状RNA(circRNA)的方法。

技术介绍

[0002]circRNA因其重要的生物学功能和稳定的结构，而被认为是多种疾病的生物标志物。然而，阻碍circRNA临床应用的一个关键挑战是缺乏有效的分析方法，因为circRNA的同源线性RNA是导致检测错误的重要干扰因素。在这项工作中，已经开发了一种可以直接分析circRNA并消除其同源线性RNA干扰的方法。该方法基于双功能识别发夹探针(ih)，并结合了HCR信号放大的优点。在这里，ih探针不仅可以识别并结合靶标circRNA，还可以启动后续的HCR过程，而且ih探针对同源线性RNA不响应，因此同时确保了circRNA检测的高特异性和信号扩增效果。
[0003]环状RNA(CircRNA)是一种新型的内源性非编码RNA，具有共价闭合的环状结构。最近的研究表明，环状RNA在肿瘤、心血管疾病和神经系统疾病等多种疾病的调控中起着至关重要的作用。此外，由于环状RNA的其他特征，包括稳定性、保守性和组织时间特异性，环状RNA被认为是各种疾病的潜在生物标志物。因此，环状RNA的检测对于疾病的诊断和分子生物学的功能分析具有重要意义。然而，由于同源线性RNA的干扰和低丰度，准确的环状RNA分析仍然是一个挑战。值得注意的是，外显子环状RNA可以通过顺式反向剪接形成，这些环状RNA与其同源的线性RNA具有相同的序列，这使得检测环状RNA变得困难。因此，迫切需要一种灵敏的方法来特异性检测环状RNA，而不受其同源线性RNA的干扰。
[0004]目前，最广泛的分析方法是qPCR。在qPCR中，研究者经常设计不同的引物，以确保环状RNA扩增的特异性，以避免线性RNA引起的干扰。然而，在逆转录过程中，环状RNA，特别是短序列的环状RNA，通常会触发滚动环扩增(RCA)来扩增含有重复片段的长链。作为qPCR的模板，这条长链会导致假阳性信号的产生。鉴于利用qPCR分析环状RNA的固有缺点，近年来一些新的环状RNA检测技术逐渐发展起来。例如，逆转录滚动扩增(RT
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RCA)，RT
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RCA利用环状RNA的环状结构来实现快速检测环状RNA的目的。然而，一个关键的缺陷是，以RNA为模板的RCA不适合用于长序列的环状RNA。
[0005]在此，针对这些问题，本专利技术提出了一种新的策略来提高环状RNA的检测特异性，并且它可以直接在不经过RNAseR处理的血清样本中进行检测。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的问题，本专利技术提供了一种基于双功能识别发夹探针的荧光生物传感器及其特异性检测环状RNA的方法。
[0007]为达到上述目的，本专利技术采用了下列技术方案：本专利技术的一种基于双功能识别发夹探针的荧光生物传感器，所述的基于双功能识别发夹探针的荧光生物传感器包括双功能
识别发夹探针ih，所述的探针ih的基因序列为SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，所述的双功能识别发夹探针ih探针的一端用于识别靶标circRNA的保守区域；所述的双功能识别发夹探针ih探针的另一端用于引发后续的杂交链反应HCR。
[0008]进一步地，所述的双功能识别发夹探针ih探针的另一端用于引发后续的杂交链反应HCR包括探针H1和探针H2，H1与H2发生HCR产生长链释放荧光，所述的探针H1的基因序列为SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，所述的探针H2的基因序列为SEQ ID No.5所示的核苷酸序列。
[0009]本专利技术所述的基于双功能识别发夹探针的荧光生物传感器及其特异性检测环状RNA的方法，包括如下步骤：(1)所述的双功能识别发夹探针ih探针的一端用于识别靶标circRNA的保守区域，识别靶标之后，ih被打开；(2)所述的双功能识别发夹探针ih探针的另一端用于引发后续的杂交链反应HCR，带来信号放大效果。
[0010]进一步地，在步骤(1)中，ih的识别区域(e*+d*)与circRNA的BSJ序列(e+d)杂交，导致ih展开暴露出引发链(b*+a*)；在步骤(2)中，引发链与H1的一部分(a*+b)结合从而打开发夹结构，恢复荧光信号。
[0011]进一步地，在步骤(2)中，另一部分(c+b*)继续与H2杂交，导致H2展开并继续与游离的H1结合，开始级联杂交并产生高度放大的信号增益。
[0012]有益效果：本专利技术的ihHCR方法不仅提高了环状RNA检测的特异性，避免了同源线性RNA的干扰，也保留了HCR的高信号扩增能力，它有实际应用前景揭示环状RNA在不同样本的差异表达，从而引导环状RNA相关疾病的研究，如本专利技术中就以circMTO1
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一种肝癌生物标志物为模式标志物验证。
[0013]与传统的circRNA检测方法相比，本专利技术具有以下显著的优势：
[0014](1)本专利技术成功开发了一种专门用于circRNA特异性分析的ihHCR方法，实现了对circRNA的准确、灵敏的定量检测。首先，利用双功能探针(ih)识别靶标circRNA的保守区域。然后触发随后的HCR过程。减少circRNA的同源线性RNA的存在带来的假阳性检测信号。
[0015](2)本专利技术可以直接检测没有RNaseR处理过得的复杂生物样本中的circRNA；整个检测过程无需酶辅助。虽然本文提出了基于ihHCR的circRNA检测方法，但该方法可以通过轻松替换ih探针的识别序列，适用于其它非编码RNA的分析。
附图说明
[0016]图1为本专利技术的利用双功能识别发夹探针(ih)结合HCR构建的区分circRNA及其同源线性RNA的ihHCR方法原理示意图。
[0017]图2为本专利技术的可行性验证图。
[0018]图2A为本专利技术的6％ PAGE图像显示了circRNA触发了ihHCR反应形成长链。图2B为本专利技术的ihHCR对circRNA、同源线性RNA(linearRNA)和circRNA+linearRNA的荧光响应图。
[0019]图3为本专利技术的ihHCR法的灵敏性分析图。图3A为本专利技术的加入不同浓度的靶标circRNA后ihHCR响应的的荧光光谱。图3B为本专利技术的不同浓度circRNA对应荧光强度的散点图，插图是荧光强度与circRNA浓度之间的线性关系。
[0020]图4A为本专利技术的ihHCR方法对靶标circMTO1s，circRNA+linearRNA和linearRNA的特异性分析。图4B为本专利技术的对circMTO1s和1个碱基突变，2个碱基突变的靶标及miRNA
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的特异性分析。图4C为本专利技术的分别在杂交缓冲液和10％血清中分析不同浓度的circMTO1。
具体实施方式
[0021]下面结合实施例对本专利技术作进一步的详述。实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于双功能识别发夹探针的荧光生物传感器，其特征在于：所述的基于双功能识别发夹探针的荧光生物传感器包括双功能识别发夹探针ih，所述的探针ih的基因序列为SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，所述的双功能识别发夹探针ih探针的一端用于识别靶标circRNA的保守区域；所述的双功能识别发夹探针ih探针的另一端用于引发后续的杂交链式反应(HCR)。2.根据权利要求1所述的基于双功能识别发夹探针的荧光生物传感器，其特征在于：所述的双功能识别发夹探针ih探针的另一端用于引发后续的HCR，H1与H2探针发生HCR反应产生长链释放荧光，所述的探针H1的基因序列为SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，所述的探针H2的基因序列为SEQ ID No.5所示的核苷酸序列。3.权利要求1所述的基于双功能识别发夹探针的荧光生物传感器用于特异性检测环状RNA的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)所述的双功能识别发夹探针ih探针的一端...

【专利技术属性】
技术研发人员：焦瑾，王刚，
申请(专利权)人：山东第一医科大学山东省医学科学院，
类型：发明
国别省市：