COL-12过表达线虫模型及其在药物筛选中的应用制造技术

本发明专利技术属于药物筛选与评价方法领域，涉及医药技术领域，具体涉及一种COL

【技术实现步骤摘要】
COL
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12过表达线虫模型及其在药物筛选中的应用


[0001]本专利技术属于药物筛选与评价方法领域，涉及医药
，具体涉及一种COL
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12过表达线虫模型及其在药物筛选中的应用。

技术介绍

[0002]线虫以其体型小(新孵化幼虫体长0.25mm，成年线虫体长约1mm)、后代数量大(一条未同雄性杂交的雌雄同体约产后代300条)、生命周期短(从孵化到性成熟并开始产卵于25℃仅需三日)、通体透明、基因组遗传学背景了解程度清晰(全基因组已测序完成，雌雄同体自交繁衍便于获得并保留纯合型转基因或基因突变)、易于进行基因编辑操作(显微注射和RNA干扰操作简便)和养护花费小等许多优点，成为了经典的实验模式生物。高通量药物筛选技术具有样品需求量小、检测快速灵敏以及高度自动化等优点，被广泛的应用于大量样品的检测，达到低消耗高产出的实验结果，为药物发现提供新思路，而高内涵药物筛选技术在线虫模型上的应用较少。
[0003]COL
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12是角质层的结构成分，是胶原蛋白三聚体的一部分。胶原蛋白是一类蛋白质家族，是生物高分子，胶原蛋白种类较多，常见类型为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、
Ⅴ
型和
Ⅺ
型。根据其结构，可以分为纤维胶原、基膜胶原、微纤维胶原、锚定胶原、六边网状胶原、非纤维胶原、跨膜胶原等。目前，一般认为，胶原蛋白具备以下三个特点：1)至少具有一个三螺旋结构域；2)能够形成超分子聚集体；3)能够存在于细胞外基质中。同时，胶原蛋白因具有良好的生物相容性、可生物降解性、生物活性以及修复和更新肌肤的作用，而被应用于食品、医药、组织工程、化妆品等领域。
[0004]中国专利CN114058672A公开了一种高通量快速检测沙门氏菌毒力的秀丽隐杆线虫感染模型及制备方法与应用，所述的模型的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)沙门氏菌的培养及菌液的制备；(2)秀丽隐杆线虫的同期化培养，得到L4期线虫；(3)将步骤(2)得到的L4期线虫在含有步骤(1)得到的沙门氏菌菌液中共同培养2
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4天即可。该专利技术通过建立沙门氏菌感染秀丽隐杆线虫模型，可以实现快速、简便、高效检测沙门氏菌毒力，为沙门氏菌的致病机理研究以及相关药物开发提供理论基础。
[0005]陈丽红等在文献利用秀丽隐杆线虫构建抗菌物质体内筛选模型中，利用秀丽隐杆线虫为模式生物，建立抗菌物质活体筛选模型，以铜绿假单孢菌感染线虫后，加入不同剂量已知抗生素治疗，观察线虫存活情况及体内细菌数量的变化，结果表明，线虫感染程度可量化操作，最佳操作参数为：铜绿假单孢菌培养时间10
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12h，菌液浓度A600值1.0
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1.2，线虫感染时间15h，抗生素的使用能够显著提高感染线虫存活状况，线虫存活率和药物剂量之间具有稳定的线性关系。但在现有技术中均未公开COL
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12过表达线虫模型，Pcol
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19
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COL
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12::GFP单拷贝转基因线虫模型的建立是全新的线虫模型，该模型可以反映胶原蛋白的分泌，可用于研究胶原分泌和组装等。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种COL
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12过表达线虫模型及其在药物筛选中的应用。
[0007]为实现上述专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：
[0008]一方面，本专利技术提供了一种COL
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12过表达线虫模型建立的方法，包括以下步骤：
[0009](1)同源修复模板质粒的构建：Destination质粒和Entry质粒进行目的序列片段的交换重组，孵育，转化入大肠杆菌，涂布于培养基；
[0010](2)显微注射和基因编辑：所述基因编辑为基于同源重组修复和crispr/cas9系统原理的基因编辑；向线虫中显微注射质粒，所述质粒包括质粒pSX493、质粒pSX2796、质粒pSX375、质粒pSX424和质粒pSX379；
[0011](3)荧光筛选单拷贝转基因线虫：在注射成功的线虫培养板表面滴加潮霉素B，培养；挑选出注射成功的线虫，子代全部呈现旋转表型或是成年期皮肤表达绿色荧光时，取子代线虫裂解得基因组，进行PCR反应；挑选纯合单拷贝转基因线虫进行热激处理。
[0012]优选地，所述步骤(1)中Entry质粒携带Pcol
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COL
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12::GFP表达序列；Destination质粒携带线虫一号染色体ttTi4348位点模板。
[0013]优选地，所述步骤(1)中Destination质粒的扩增用DB3.1感受态细胞。
[0014]优选地，所述步骤(1)中Entry质粒的扩增选自载体pCR8或载体pDONR。
[0015]具体的，所述载体pCR8含有壮观霉素抗性；
[0016]具体的，所述载体pDONR含有卡那霉素抗性。
[0017]优选地，所述步骤(1)中重组反应体系包括Entry质粒、Destination质粒、5x LR reaction enzyme mix和缓冲液。
[0018]进一步优选地，所述缓冲液选自HEPES缓冲液、TE缓冲液中的至少一种。
[0019]优选地，所述步骤(1)中Entry质粒和Destination质粒的质量比为(0.04
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1):1。
[0020]进一步优选地，所述步骤(1)中Entry质粒和Destination质粒的质量比为1:1。
[0021]优选地，所述步骤(1)中孵育的温度为25℃，孵育的时间为1h。
[0022]优选地，孵育后加入蛋白酶K进行孵育；所述蛋白酶K的浓度为20mg/mL，孵育的时间为10min。
[0023]优选地，所述大肠杆菌宿主为DH5α。
[0024]优选地，所述步骤(1)中培养基为氨苄青霉素抗性琼脂选择培养基。
[0025]优选地，步骤(2)中所述线虫为L4幼虫期雌雄同体线虫。
[0026]具体的，所述注射质粒pSX493(Peft
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cas9
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NLS
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pU6
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pCFJ210 sg on Chr I)，能够编码表达Cas9和染色体I ttTi4348位置处的引导RNA；
[0027]具体的，所述质粒pSX2796(pCFJ210
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LoxP
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SEC
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Loxp
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Pcol
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COL
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12::GFP modified for CRISPR on Chr I)为同源修复模板；
[0028]具体的，所述质粒pSX375(Pmyo
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mcherry)，pSX424(Pmyo
‑3本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种COL
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12过表达线虫模型建立的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)同源修复模板质粒的构建：Destination质粒和Entry质粒进行目的序列片段的交换重组，孵育，转化入大肠杆菌，涂布于培养基；(2)显微注射和基因编辑：所述基因编辑为基于同源重组修复和crispr/cas9系统原理的基因编辑；向线虫中显微注射质粒，所述质粒包括质粒pSX493、质粒pSX2796、质粒pSX375、质粒pSX424和质粒pSX379；(3)荧光筛选单拷贝转基因线虫：在注射成功的线虫培养板表面滴加潮霉素B，培养；挑选出注射成功的线虫，子代全部呈现旋转表型或是成年期皮肤表达绿色荧光时，取子代线虫裂解得基因组，进行PCR反应；挑选纯合单拷贝转基因线虫进行热激处理。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中Entry质粒携带Pcol
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COL
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12::GFP表达序列；Destination质粒携带线虫一号染色体ttTi4348位点模板。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中Entry质粒和Destination质粒的质量比为(0.04
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【专利技术属性】
技术研发人员：王毅，徐素宏，张舒静，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：