一种制备CAR-T细胞的方法以及制得的CAR-T细胞及其应用技术

本发明专利技术提供了一种制备CAR

【技术实现步骤摘要】
一种制备CAR
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T细胞的方法以及制得的CAR
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T细胞及其应用


[0001]本专利技术涉及CAR
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T细胞
，特别涉及一种制备CAR
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T细胞的方法以及制得的CAR
‑
T细胞及其应用。

技术介绍

[0002] 目前，细胞治疗领域因其高度精准化和个性化的优势，已成为未来人类医学发展的热门方向。细胞治疗是指应用人的自体、同种异体或异种( 非人体) 的细胞，经体外操作后回输( 或植入) 人体的治疗方法。其中嵌合抗原受体T 细胞免疫疗法( CAR
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T细胞疗法) 是近几年兴起的过继性细胞免疫治疗，主要通过将嵌合抗原受体的特异性与T 细胞的免疫作用相结合，再经过特异性识别对恶性肿瘤细胞进行杀伤。CAＲ
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T 细胞疗法的传统领域主要是治疗血液恶性肿瘤，临床效果较好。
[0003]人表皮生长因子受体2(HER2)是一种受体酪氨酸蛋白激酶，其过表达对于肿瘤的发生、发展与转移起着关键性作用。自1998年FDA批准曲妥珠单抗以来，特异性单克隆抗体治疗改变了HER2阳性肿瘤的治疗，在化疗中加入曲妥珠单抗可降低死亡率延长生存期，并降低20％的死亡风险。然而，一些HER2阳性肿瘤患者用药后并没有取得良好效果或者渐渐产生耐药反应；因此，需要进一步研究新的方法来治疗HER2过表达的肿瘤患者。因此，本专利技术的目的旨在设计一种靶向HER2的CAR
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T细胞制备方法以及制得的CAR
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T细胞及其应用。
[0004]
技术实现思路

[0005]针对现有技术所存在的技术问题，本专利技术提供了一种制备CAR
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T细胞的方法以及制得的CAR
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T细胞及其应用。本专利技术提供的嵌合抗原受体能够特异识别HER2抗原，具有良好的靶向性，能够用于肿瘤的靶向治疗。
[0006]本专利技术的目的之一在于提供一种靶向HER2的CAR
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T表达载体，其特征在于，所述表达载体包含靶向HER2的CAR基因序列；优选地，所述靶向HER2的CAR依次是由CD8α信号肽、靶向HER2的单链抗体、CD8a铰链区、CD8a跨膜结构域、CD28蛋白共刺激结构域和CD3ζ胞信号传导结构域组成；进一步地，所述靶向HER2的CAR
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T的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；优选地，所述CD8α信号肽序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其编码的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；优选地，靶向HER2的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，其编码的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；优选地，CD8a铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，其编码的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；优选地，CD8a跨膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，其编码的核苷酸序列
如SEQ ID NO.10所示；优选地，CD28蛋白共刺激结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，其编码的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；优选地，CD3ζ胞信号传导结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，其编码的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；本专利技术的另一个目的之一在于提供一种靶向HER2的CAR
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T表达载体的构建方法，以靶向HER2的嵌合抗原受体基因为目的基因，利用重组慢病毒包装系统，构建获得靶向HER2的CAR
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T表达载体。
[0007]本专利技术的另一个目的之一在于提供一种CAR
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T细胞，使用上述CAR
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T表达载体转导T淋巴细胞获得。
[0008]本专利技术的另一个目的之一在于上述CAR
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T表达载体或CAR
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T细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0009]优选地，上述肿瘤为HER2过表达肿瘤。
[0010]优选地，上述肿瘤包括HER2阳性乳腺癌。
[0011]本专利技术的优点如下：本专利技术提供的嵌合抗原受体能够特异识别HER2抗原，具有良好的靶向性，包含该嵌合抗原受体的CAR
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T细胞在体外表现出很好杀伤能力，并且其在体内实验中，同样显示出很好的抗原靶向性和肿瘤杀伤活性，因此，本专利技术制备的CAR
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T细胞能够用于肿瘤的靶向治疗。
附图说明
[0012] 图1. CAR
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T细胞体外对肿瘤细胞特异性杀伤作用；图2. CAR
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T细胞体内对肿瘤细胞特异性杀伤作用。
具体实施方式
[0013]下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本专利技术。
[0014]以下各实施例，仅用于说明本专利技术，并不用来限制本专利技术的范围。基于本专利技术中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本专利技术的保护范围。
[0015] 在本专利技术实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本专利技术实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0016]1.1 CAR表达序列的设计一种靶向HER2的CAR依次是由CD8α信号肽、靶向HER2的单链抗体、CD8a铰链区、CD8a跨膜结构域、CD28蛋白共刺激结构域和CD3ζ胞信号传导结构域组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0017] 其中，CD8α信号肽序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其编码的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；靶向HER2的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，其编码的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；CD8a铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，其编码的核
苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；CD8a跨膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，其编码的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；CD28蛋白共刺激结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，其编码的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；CD3ζ胞信号传导结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，其编码的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；1.2 慢病毒的构建将设计的CAR基因序列插入至慢病毒骨架质粒pCDH
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EF1
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MCS(购自Addgene)中的EcoRI和BamH1酶切位点之间,将重组慢病毒质粒于所设计基因序列两端的酶切位点使用限制性内切酶进行双酶切后，进行SDS
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PAGE电泳，选择与设计酶切片段一致大小的片段区域进行胶回收，经测序鉴定获得序列正确的阳性克隆质粒本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1. 一种靶向HER2的CAR
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T表达载体，其特征在于，所述表达载体包含靶向HER2的CAR基因序列；所述靶向HER2的CAR依次是由CD8α信号肽、靶向HER2的单链抗体、CD8a铰链区、CD8a跨膜结构域、CD28蛋白共刺激结构域和CD3ζ胞信号传导结构域组成；所述靶向HER2的CAR
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T的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。2. 如权利要求1所述的靶向HER2的CAR
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T表达载体，其特征在于，所述CD8α信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其编码的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。3. 如权利要求1所述的靶向HER2的CAR
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T表达载体，其特征在于，所述靶向HER2的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，其编码的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。4. 如权利要求1所述的靶向HER2的CAR
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T表达载体，其特征在于，所述CD8a铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，其编码的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。5. 如权利要求1所述的靶向HER2的CAR
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T表达载体，其特征在于，所述CD8a跨膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID ...

【专利技术属性】
技术研发人员：史辛艺，王泰华，
申请(专利权)人：广东赛尔生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：