【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物细胞培养，具体涉及一种皮肤来源成纤维细胞的分离培养方法。
技术介绍
1、成纤维细胞是结缔组织中最常见的细胞，成纤维细胞的功能活动旺盛，具有较强的适应性和分裂增殖能力，通过连续分泌细胞外基质前体来维持结缔组织的结构完整。成纤维细胞能合成并分泌大量的细胞外基质和胶原纤维，与新生的毛细血管形成肉芽组织，从而起到伤口修复并治愈的效果；另外，成纤维细胞还具有修复创伤性骨损伤，以及具有合成和分泌蛋白质的功能。因此，在生物医学上，以及生物研究中，常需要进行成纤维细胞的培养，以供大量使用需求。
2、现有皮肤成纤维细胞的分离培养方法主要有两类：酶消化法和组织块法。其中，酶消化法是利用胰蛋白酶、胶原酶等对皮肤组织进行消化，去除组织表皮后，进行离心、重悬和培养，得到皮肤成纤维细胞；而组织块法则是将皮肤的小组织块直接接种于培养皿中进行培养。
3、目前，酶消化法存在分离培养周期长，10天～14天才能够传代，且酶解也会对细胞产生一定负面影响，降低细胞活性，使之贴壁率低，收率低；而组织块法也存在培养周期长，20天左右才能够进行传代，贴壁率低和收率也较低；满足不了品质和数量的需求。因此，需要不断改进分离培养方法，以提高成纤维细胞的分离培养质量、数量和效率。
技术实现思路
1、针对现有酶消化法和组织块法存在分离培养周期长、细胞活性低、贴壁率低，分离培养活性、数量和效率都有待提高的问题。本专利技术提供一种皮肤来源成纤维细胞的分离培养方法，在分离过程中，利用添加适量的角鲨烷和依
2、一种皮肤来源成纤维细胞的分离培养方法，包括如下步骤：
3、s1，真皮组织的提取：
4、采用dispaseⅱ消化液对皮肤组织进行消化后去除表皮部分，得到真皮组织；
5、s2，原代细胞的分离：
6、将真皮组织剪切成0.1cm2～0.3cm2的碎片，得到真皮组织碎片，然后加入胶原酶iv消化液、角鲨烷和依克多因，在36.5℃～37.5℃，进行水浴震荡酶解消化20min～30min，之后加入1.5倍～3倍体积的生理盐水终止酶解消化，离心分离，弃去上清液，之后采用生理盐水洗涤，离心分离，收集沉淀物；
7、s3，原代细胞的培养：
8、将沉淀物悬浮于培养基中，再转入包被培养皿中，在36.5℃～37.5℃，co2体积浓度为5%～6%的培养箱中进行培养，18h～22h后进行换新培养基，并弃去未贴壁的细胞；继续培养，每隔24h～25h换新培养基，培养第5天～第6天，细胞汇合度达到80%～90%，即能够进行后续消化传代；
9、所述包被培养皿的内壁具有包被膜，所述包被膜含有角鲨烷、依克多因、岩藻聚糖、β-环糊精和卡拉胶。
10、上述方法的s3中，所述包被培养皿的制备方法为，在培养皿内表面涂覆食品级硅胶溶液，凝固后形成一层食品级硅胶薄膜；然后在食品级硅胶薄膜表面涂覆一层复合液，干燥后形成一层包被膜。
11、所述复合液的组成质量份数为，0.2份～0.5份角鲨烷、0.2份～0.5份依克多因、0.1份～0.5份岩藻聚糖、0.3份～0.8份β-环糊精、0.1份～1份卡拉胶和100份纯化水，所述复合液的温度为70℃～80℃。
12、上述方法的s1中，所述真皮组织的提取的具体方法为：取新鲜的皮肤组织，采用清洗液进行清洗干净，人工剥离附带的脂肪组织后，将皮肤组织裁剪成0.5cm2～1cm2的小块，得到皮肤组织碎块，然后加入dispaseⅱ消化液中，在36.5℃～37.5℃进行水浴震荡酶解消化1h～1.5h，之后加入1.5倍～3倍体积的生理盐水终止酶解消化，之后取出皮肤组织碎块，人工去除表皮部分，得到真皮组织。
13、所述清洗液为含200iu/ml～400iu/ml青霉素、200iu/ml～400iu/ml链霉素、8%～12%体积含量fbs、4.5g/l～5g/l葡萄糖的dmem。
14、所述dispaseⅱ消化液的用量为皮肤组织碎块质量的5倍～8倍；所述dispaseⅱ消化液中dispaseⅱ质量浓度为0.3%～0.6%。
15、上述方法的s2中，所述胶原酶iv消化液的用量为真皮组织碎片质量的5倍～8倍；所述胶原酶iv消化液中胶原酶iv质量浓度为0.2%～0.4%。
16、上述方法的s2中，所述角鲨烷的添加量为真皮组织碎片质量的0.5%～5%；所述依克多因的添加量为真皮组织碎片质量的0.5%～5%。
17、上述方法的s2中，所述离心分离的转速为1500rpm～1800rpm，时间为5min～6min。
18、上述方法的s3中，所述培养基的用量为沉淀物质量的2倍～4倍；所述培养基为含有胎牛血清、青霉素和链霉素的高糖dmem培养基，其中，胎牛血清的体积含量为10%～20%，青霉素的含量为100u/ ml～120u/ ml，链霉素的含量为100u/ ml～120u/ ml，葡萄糖的含量为4.5g/l～5g/l。
19、本专利技术的一种皮肤来源成纤维细胞的分离培养方法，与现有技术相比，有益效果为：
20、一、本专利技术分离培养方法设计在胶原酶iv消化时添加角鲨烷和依克多因，角鲨烷和依克多因对成纤维细胞具有良好的保护作用，在酶解消化过程中减轻胶原酶iv对成纤维细胞的损害，保持较高的存活率和活性。其中，角鲨烷为最接近人体皮脂的一种脂类，亲和力强，角鲨烷能够使成纤维细胞保持良好的柔润弹性，形成一层天然的保护屏障，保护细胞不受损伤；依克多因能够调节细胞渗透压，自然形成的防护盾，减少受到胶原酶iv消化液的伤害，保持良好细胞活性。
21、二、本专利技术分离培养方法设计包被培养皿的内壁具有包被膜，包被膜含有角鲨烷、依克多因、岩藻聚糖、β-环糊精和卡拉胶。包被膜的设计能够提高成纤维细胞的贴壁率，增大收率，且能够提高细胞的汇合速度，在培养第5天～第6天，细胞汇合度达到80%～90%。其中，包被膜中的角鲨烷和依克多因用于保持贴壁细胞的活性；岩藻聚糖用于促进成纤维细胞贴壁和汇合。
22、三、本专利技术方法设计在培养皿内表面涂覆食品级硅胶溶液，凝固后形成一层食品级硅胶薄膜；然后在食品级硅胶薄膜表面涂覆一层复合液，干燥后形成一层包被膜。其中，食品级硅胶薄膜作为打底膜，能够很好的附着复合液，形成包被膜，使包被膜长期使用不发生剥落。
23、四、包被膜中还含有β-环糊精和卡拉胶，用于粘附成膜；复合液的组成质量份数为，0.2份～0.5份角鲨烷、0.2份～0.5份依克多因、0.1份～0.5份岩藻聚糖、0.3份～0.8份β-环糊精、0.1份～1份卡拉胶和100份纯化水，所述复合液的温度为70℃～80℃。该比例参数能够实现良好的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种皮肤来源成纤维细胞的分离培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种皮肤来源成纤维细胞的分离培养方法，其特征在于，S3中，所述包被培养皿的制备方法为，在培养皿内表面涂覆食品级硅胶溶液，凝固后形成一层食品级硅胶薄膜；然后在食品级硅胶薄膜表面涂覆一层复合液，干燥后形成一层包被膜。
3.根据权利要求2所述的一种皮肤来源成纤维细胞的分离培养方法，其特征在于，所述复合液的组成质量份数为，0.2份～0.5份角鲨烷、0.2份～0.5份依克多因、0.1份～0.5份岩藻聚糖、0.3份～0.8份β-环糊精、0.1份～1份卡拉胶和100份纯化水，所述复合液的温度为70℃～80℃。
4.根据权利要求1所述的一种皮肤来源成纤维细胞的分离培养方法，其特征在于，S1中，所述真皮组织的提取的具体方法为：取新鲜的皮肤组织，采用清洗液进行清洗干净，人工剥离附带的脂肪组织后，将皮肤组织裁剪成0.5cm2～1cm2的小块，得到皮肤组织碎块，然后加入dispaseⅡ消化液中，在36.5℃～37.5℃进行水浴震荡酶解消化1h～1.5h，之后加入1.5倍～3倍
5.根据权利要求4所述的一种皮肤来源成纤维细胞的分离培养方法，其特征在于，所述清洗液为含200IU/mL～400IU/mL青霉素、200IU/mL～400IU/mL链霉素、8%～12%体积含量FBS、4.5g/L～5g/L葡萄糖的DMEM。
6.根据权利要求4所述的一种皮肤来源成纤维细胞的分离培养方法，其特征在于，所述dispaseⅡ消化液的用量为皮肤组织碎块质量的5倍～8倍；所述dispaseⅡ消化液中dispaseⅡ质量浓度为0.3%～0.6%。
7.根据权利要求1所述的一种皮肤来源成纤维细胞的分离培养方法，其特征在于，S2中，所述胶原酶IV消化液的用量为真皮组织碎片质量的5倍～8倍；所述胶原酶IV消化液中胶原酶IV质量浓度为0.2%～0.4%。
8.根据权利要求1所述的一种皮肤来源成纤维细胞的分离培养方法，其特征在于，S2中，所述角鲨烷的添加量为真皮组织碎片质量的0.5%～5%；所述依克多因的添加量为真皮组织碎片质量的0.5%～5%。
9.根据权利要求1所述的一种皮肤来源成纤维细胞的分离培养方法，其特征在于，S2中，所述离心分离的转速为1500rpm～1800rpm，时间为5min～6min。
10.根据权利要求1所述的一种皮肤来源成纤维细胞的分离培养方法，其特征在于，S3中，所述培养基的用量为沉淀物质量的2倍～4倍；所述培养基为含有胎牛血清、青霉素和链霉素的高糖DMEM培养基，其中，胎牛血清的体积含量为10%～20%，青霉素的含量为100U/ mL～120U/ mL，链霉素的含量为100U/ mL～120U/ mL，葡萄糖的含量为4.5g/L～5g/L。
...【技术特征摘要】
1.一种皮肤来源成纤维细胞的分离培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种皮肤来源成纤维细胞的分离培养方法，其特征在于，s3中，所述包被培养皿的制备方法为，在培养皿内表面涂覆食品级硅胶溶液，凝固后形成一层食品级硅胶薄膜；然后在食品级硅胶薄膜表面涂覆一层复合液，干燥后形成一层包被膜。
3.根据权利要求2所述的一种皮肤来源成纤维细胞的分离培养方法，其特征在于，所述复合液的组成质量份数为，0.2份～0.5份角鲨烷、0.2份～0.5份依克多因、0.1份～0.5份岩藻聚糖、0.3份～0.8份β-环糊精、0.1份～1份卡拉胶和100份纯化水，所述复合液的温度为70℃～80℃。
4.根据权利要求1所述的一种皮肤来源成纤维细胞的分离培养方法，其特征在于，s1中，所述真皮组织的提取的具体方法为：取新鲜的皮肤组织，采用清洗液进行清洗干净，人工剥离附带的脂肪组织后，将皮肤组织裁剪成0.5cm2～1cm2的小块，得到皮肤组织碎块，然后加入dispaseⅱ消化液中，在36.5℃～37.5℃进行水浴震荡酶解消化1h～1.5h，之后加入1.5倍～3倍体积的生理盐水终止酶解消化，之后取出皮肤组织碎块，人工去除表皮部分，得到真皮组织。
5.根据权利要求4所述的一种皮肤来源成纤维细胞的分离培养方法，其特征在于，所述清洗液为含200iu/ml～400iu/ml青霉素、200iu/ml～400iu/ml链霉素、8%～...
【专利技术属性】
技术研发人员：史辛艺，王泰华，
申请(专利权)人：广东赛尔生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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