一种快速高效构建条件性基因敲除动物模型的方法及应用技术

本发明专利技术属于动物模型构建技术领域，披露了一种构建条件性基因敲除动物模型的方法，针对靶基因外显子区域设计sgRNA靶点序列，构建质粒，将PiggyBACmRNA和质粒显微注射到C57/B6受精卵中，得到sgRNA/Cas9转基因动物，将组织特异性Cre

【技术实现步骤摘要】
一种快速高效构建条件性基因敲除动物模型的方法及应用


[0001]本专利技术属于动物模型构建
，更具体的，涉及一种快速高效构建条件性基因敲除动物模型的方法及应用。

技术介绍

[0002]CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences)/Cas9系统是一种有效简单的基因组工程工具，该技术的基本原理是：单链指导RNA(Single guide,sgRNA)可以靶向目的基因的序列并与之进行特异性结合，sgRNA引导Cas9核酸酶对目的序列进行切割，进而导致DNA双链的断裂(Double
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strandbreaks，DSB)。最后通过同源重组(Homology directed repair，HDR)或非同源末端连接(Non
‑
homologous endjoining，NHEJ)等内源性的DNA修复方式进行修复，在断裂处插入异常的碱基或者使碱基缺失，造成移码突变，最终实现基因敲除的目的。该技术因其系统成分简单、操作方便、突变效率高、成本低廉的优点，已在微生物、植物、动物及癌症基因治疗等领域得到了广泛的应用。
[0003]Cre
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loxP系统是一种广泛应用的哺乳动物基因编辑技术。该系统的优点是操作非常简单，并且不需要额外的因子来进行有效重组。为了产生特异性突变小鼠，Cre
‑
loxP系统中需要两个元件。首先，产生Cre
‑
驱动品系，其中Cre重组酶由特异性靶向目标细胞或组织的启动子表达，第二，需要产生含有loxP侧翼(floxed)DNA的小鼠品系，然后通过将Cre
‑
driver品系与floxed小鼠品系交配产生条件性敲除小鼠。因此，为了得到条件性基因敲除的纯合小鼠繁育周期较长，经济成本较高。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的问题，首先提供一种构建条件性基因敲除动物模型的方法。
[0005]本专利技术的第二个目的是提供小鼠子宫特异性快速敲除Foxa2的方法，该方法为疾病动物模型的研究奠定了基础。
[0006]本专利技术的目的通过以下技术方案实现：
[0007]一种构建条件性基因敲除动物模型的方法，包括以下步骤：
[0008]S1、针对靶基因区域设计sgRNA序列；
[0009]S2、构建PiggyBAC质粒：设计sgRNA表达元件，扩增目的片段，并将sgRNA表达元件和目的片段连接至载体骨架上得到PiggyBAC质粒；
[0010]S3、将PiggyBAC mRNA和PiggyBAC质粒注射入小鼠受精卵中，培育受精卵并传代至F1代即sgRNA/Cas9转基因小鼠；
[0011]S4、将sgRNA/Cas9转基因小鼠与组织特异性Cre
‑
driver品系进行繁育，得到针对靶基因的条件性基因敲除动物模型。
[0012]本专利技术上述方法是基于CRISPR/Cas9技术与Cre
‑
loxp系统完成的。具体方法为：针
DNA ladder；
[0031]图3是Foxa2sgRNA/Cas9转基因小鼠PCR引物位置示意图；
[0032]图4是Foxa2sgRNA/Cas9转基因小鼠基因型鉴定结果电泳图；其中，2、3、4、6、10、11为阳性小鼠标号；
[0033]图5是Foxa2 cKO小鼠特异性敲除策略示意图；
[0034]图6是Foxa2 cKO小鼠foxa2基因型PCR引物位置示意图；
[0035]图7是Foxa2 cKO小鼠foxa2基因型鉴定结果电泳图；
[0036]图8是Foxa2 cKO小鼠cre基因型PCR引物位置示意图；
[0037]图9是Foxa2 cKO小鼠cre基因型鉴定结果电泳图；
[0038]图10是Foxa2 cKO阳性小鼠基因测序峰图；
[0039]图11是Foxa2 cKO阳性小鼠靶点切割效率图；
[0040]图12是5周龄WT及Foxa2 cKO雌鼠子宫荧光检测；
[0041]图13是妊娠第5天WT及Foxa2 cKO雌鼠胚胎着床情况，箭头所指为着床位点；标尺长度：1mm；
[0042]图14是人工诱导蜕膜化模型(箭头所指为注油侧)；a:野生型雌鼠妊娠第8天子宫b:Foxa2 cKO雌鼠妊娠第8天子宫；
[0043]图15是野生型小鼠与Foxa2 cKO小鼠mRNA表达水平；
[0044]图16是免疫组化结果：妊娠第4天野生型WT雌鼠和Foxa2 cKO雌鼠子宫Foxa2的表达；注：a、b、c为野生型小鼠子宫；d、e、f为Foxa2 cKO小鼠子宫；标尺长度：100μm。
具体实施方式
[0045]以下将结合本专利技术实施例中的附图，进一步对本专利技术做进一步详细说明，并且所描述的内容，不会限制权利要求书中所描述的本专利技术。显然，所描述的实施例仅为关键的实施例，并非全部的实施例，内容对本领域的技术人员是易理解的。
[0046]下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
[0047]实施例1PiggyBAC质粒的构建及酶切验证
[0048]1、设计靶点
[0049]根据Foxa2基因(基因ID：15376)的第一外显子和第二外显子设计靶序列，所设计的sgRNA序列如下：
[0050]表1sgRNA序列信息
[0051][0052]2、表达元件和质粒的构建
[0053]设计sgRNA表达元件U6
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sgRNA1
‑
U6
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sgRNA2
‑
U6
‑
sgRNA3
‑
U6
‑
sgRNA4
‑
CAG
‑
LSL
‑3×
FLAG，序列如SEQ ID NO：5所示，送至公司进行全基因合成。
[0054]以LSL
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Cas9
‑
Rosa26TV质粒为模板，设计两对引物，对目的片段CAG
‑
LSL
‑3×
FLAGNLS
‑
Cas9
‑
NLS
‑
P2A
‑
EGFP
‑
WPRE
‑
PA进行扩增，引物序列如下表2，PCR反应体系如下表3，反应程序如下表4。
[0055]表2引物信息
[0056][0057]表3PCR反应组分
[0058][0059]表4PCR反应条件
[0060][0061]将表达元件U6
‑
sgRNA1
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种构建条件性基因敲除动物模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、针对靶基因区域设计sgRNA序列；S2、构建PiggyBAC质粒：设计sgRNA表达元件，扩增目的片段，并将sgRNA表达元件和目的片段连接至载体骨架上得到PiggyBAC质粒；S3、将PiggyBACmRNA和PiggyBAC质粒注射入小鼠受精卵中，培育受精卵并传代至F1代即sgRNA/Cas9转基因小鼠；S4、将sgRNA/Cas9转基因小鼠与组织特异性Cre
‑
driver品系进行繁育，得到针对靶基因的条件性基因敲除动物模型。2.权利要求1所述的方法在构建小鼠子宫特异性敲除Foxa2小鼠模型中的应用。3.一种用于构建Foxa2基因敲除小鼠动物模型的特异性靶位点sgRNA，其特征在于，包括sgRNA1、RNA2、sgRNA3和RNA3，所述sgRNA1、RNA2、sgRNA3和RNA3的序列如下：sgRNA1：AAGGGCACGAGCCATCCGAC；sgRNA2：CAGCTACTACGCGGAGCCCG；sgRNA3：CGGTTCCGGCAACATGAGCG；sgRNA4：GGAATGAGCCCGTCGCTAGC。4.一种子宫特异性敲除Foxa2小鼠模型的快速构建方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、构建PiggyBAC质粒：设计针对权利要求3所述sgRNA的表达元件，扩增目的片段，并将sgRNA表达元件和目的片段连接至P...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨世华，张子琦，郑展宏，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：