一种基于电化学发光的单分子检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于电化学发光的单分子检测方法，包括待测物的捕获、标记体系，电化学发光反应体系，光子信号采集体系和单分子数据处理体系,电化学发光反应体系用于触发待测物上的探针分子发生电化学反应产生可被探测到的光信号,光子信号采集体系用于采集电化学发光反应释放的单个光子信号或孤立的极少量光子信号，单分子数据处理体系用于将孤立光子信号与单分子数目相关联。利用本发明专利技术的光子信号采集体系及孤立光子信号处理体系所包含的上述技术方案，能够实现单分子的探测、定位和定量。本发明专利技术突破传统电化学发光免疫分析技术灵敏度的局限，实现了单个分子级别的检出，对癌胚抗原的检出限低于10fg/mL。癌胚抗原的检出限低于10fg/mL。癌胚抗原的检出限低于10fg/mL。

【技术实现步骤摘要】
一种基于电化学发光的单分子检测方法


[0001]本专利技术涉及电化学发光分析领域，尤其涉及一种基于电化学发光的单分子检测方法，本方法可适用于单分子免疫分析、单分子核酸分析和其他类似地单分子分析领域。

技术介绍

[0002]检测血清中疾病标志物的含量对于临床上的疾病诊断和监测具有重要意义。目前临床上检测血清中疾病标志物的方法主要利用免疫分析方法，即通过待测抗原与标记抗体的特异性识别和结合达到单一标志物检出的目的。利用当前的免疫分析方法测定可实现血清中大多数蛋白质的检出，但是对于疾病发展前期所出现的低表达丰度蛋白还无法实现精准测量。据研究，在大多数癌症和感染早期阶段血清中疾病标志物的含量在10
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16
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mol/L之间，然而大多数免疫测定方法只能检出高于10
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mol/L的标志物。因此迫切需要开发一种新的免疫测定方法来检测低表达癌症标志物的存在。
[0003]单分子检测技术是解决上述问题的一条有效途径，将检测灵敏度降低到单个分子水平可以有效地降低检测限，从而实现对低表达蛋白的检出。目前在免疫分析领域应用较为成熟的单分子检测技术是单分子荧光方法，通过在极小的反应阵列中对标记有荧光探针的免疫分析复合物进行分离，通过激光激发该复合物，统计其荧光强度的分布以实现单分子级别的检出。然而，使用激光会存在光漂白和受背景信号干扰的问题，从而影响检测的准确性。
[0004]电化学发光由于不受背景信号干扰，便于用电压调控，且具有较高的灵敏度在免疫分析领域备受青睐。目前用电化学发光方法已经实现了对血清中较低浓度蛋白质的检出，比如使待测蛋白与探针分子标记的核苷酸特异性结合可实现低至28.75aM的检出限。另一种降低检测限的方法是增加与检测抗体偶联的探针分子的浓度，例如以掺杂Ru(bpy)
32+
的SiO2/Au纳米颗粒作为发光探针可以有效增强电化学发光信号从而实现低浓度待测物的检出。然而，上述电化学发光方法都引入了较多的偶联步骤，增加了检测复杂性，并且均未从单分子水平上对蛋白质实现检出，绝对灵敏度均较低且不具备空间分辨的能力。
[0005]到目前为止，很少有研究使用电化学发光技术在单分子水平上检测和量化生物大分子待测物。我们则开发了一种单分子电化学发光方法并研究其在免疫分析领域的应用。该方法操作简单，无需多余的偶联步骤，通过分析电化学发光过程中产生的孤立光子信号即可实现对单个待测物分子的精准定位和定量。该方法的一大优势是将孤立光子信号与单分子信息相结合，从根本上将免疫分析的灵敏度提升到单分子水平，有利于我们从单个蛋白层面理解一些生命过程及其作用机理。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种基于电化学分析的分析方法并探究其在生物分子检测方面的应用。以常见的癌胚抗原免疫分析体系为例，该方法可以突破传统电化学发光免疫分析技术灵敏度的局限，实现单个分子级别的检出，对癌胚抗原的检出限低于10fg/mL。
[0007]为实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：
[0008]本专利技术公开了一种基于电化学发光的单分子检测方法，包括待测物的捕获、标记体系，电化学发光反应体系，光子信号采集体系和单分子数据处理体系,电化学发光反应体系用于触发待测物上的探针分子发生电化学反应产生可被探测到的光信号,光子信号采集体系用于采集电化学发光反应释放的单个光子信号或孤立的极少量光子信号，单分子数据处理体系用于将孤立光子信号与单分子数目相关联。
[0009]作为进一步地改进,本专利技术所述的电化学发光反应体系通过电化学发光反应单元与主机来实现；电化学发光反应单元包括内部盛有电化学反应物的样品池、工作电极、参比电极、对电极、采集卡或电化学工作站或其它可施加电压的触发装置，工作电极、参比电极、对电极设置在样品池中，采集卡分别与参比电极、对电极、工作电极和主机相连，所述的电化学反应物包括免疫分析复合物和共反应剂。
[0010]作为进一步地改进,本专利技术所述的采集卡通过主机设置预设电压并向工作电极和对电极施加电压，采集参比电极和工作电极两端的电压，并将采集的电压值发送至主机，主机将采集卡采集的电压值与预设电压值进行对比，并根据对比结果控制采集卡调整向工作电极和对电极发送电压信号。
[0011]作为进一步地改进,本专利技术所述的电化学反应物中还包括游离的探针分子用于参与电化学发光反应中的催化路径以增强共反应剂路径产生的电化学信号。解决了传统电化学免疫分析体系中发光信号弱的问题。
[0012]作为进一步地改进,本专利技术所述的光子信号采集体系通过光子信息采集单元和主机来实现，光子信息采集单元包括显微成像系统和光子探测器；显微成像系统设置在样品池正下方的位置，并与光子探测器连接，光子探测器的另一端与主机连接。
[0013]作为进一步地改进,本专利技术所述的光子探测器用于连续采集样品池中释放的孤立光子信号，并依次将其发送至主机，主机根据光子探测器发送的孤立光子信号生成用于分析处理的灰度图像。
[0014]作为进一步地改进,本专利技术在时间和空间上都较为孤立的孤立光子信号是通过控制反应物浓度和采集的曝光时间获得的，其中共反应剂浓度范围：1皮摩尔每升至200毫摩尔每升；免疫分析复合物的浓度范围：50微克至5毫克每升；曝光时间范围：10微秒至50毫秒。其突出采集参数，只有采集到孤立光子信号或孤立的光子信号才可进行后续分子的定位。
[0015]作为进一步地改进，本专利技术所述的孤立光子信号包含光子在当前时刻的像素位置及与其相邻的多个像素的灰度值信息。
[0016]作为进一步地改进，本专利技术所述的显微成像系统上装有高数值孔径的油浸显微物镜。
[0017]作为进一步地改进，本专利技术所述的光子探测器为电子倍增相机或互补氧化物半导体相机或光电倍增二极管或雪崩光电二极管或具有高灵敏度的光电探测器及其阵列。
[0018]作为进一步地改进，本专利技术所述的单分子数据处理体系是将孤立光子信号与单分子位置信息相关联，通过主机分析上述光子探测器发来的上述单个光子或孤立的极少量光子的像素及与其相邻的多个像素的灰度值信息，利用二维高斯或其它具有空间定位功能的函数对其空间位置进行拟合来获取单个光子或孤立的极少量光子的定位信息及其标准差。
用该定位方法可确定准确的发光分子位置。
[0019]作为进一步地改进，对多个采集时间内定位到的多个单个光子或孤立的极少量光子的空间位置进行累加可得到突破光学衍射极限的定位图像，对上述定位点进行降噪处理以及相同信号的合并后可由校正后的单分子定位信息确定标记分子的数目。提高由定位确定分子数目的准确性。
[0020]作为进一步地改进，所述相同信号的合并可以通过设置时间阈值或空间阈值对定位信号进行后处理，减小由于重复定位造成的过度计数情况。
[0021]作为进一步地改进，所述的检测方法用于基于电化学发光的单分子免疫分析、基于电化学发光的单分子核酸分析、以及原理上类似地包括其他本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于电化学发光的单分子检测方法，其特征在于，包括待测物的捕获、标记体系，电化学发光反应体系，光子信号采集体系和单分子数据处理体系,所述电化学发光反应体系用于触发待测物上的探针分子发生电化学反应产生可被探测到的光信号，所述光子信号采集体系用于采集所述电化学发光反应释放的单个光子信号或孤立的极少量光子信号，所述单分子数据处理体系用于将光子信号与单分子数目相关联。2.根据权利要求1所述的电化学发光的单分子检测方法，其特征在于，所述电化学发光反应体系通过电化学发光反应单元与主机来实现；所述的电化学发光反应单元包括内部盛有电化学反应物的样品池、工作电极、参比电极、对电极、采集卡或电化学工作站或其它可施加电压的触发装置，所述工作电极、参比电极、对电极设置在所述样品池中，所述采集卡分别与参比电极、对电极、工作电极和主机相连，所述的电化学反应物包括电化学发光探针分子同目标待分析分子的结合物。3.根据权利要求2所述的基于电化学发光的单分子检测方法，其特征在于，所述采集卡通过主机设置预设电压并向工作电极和对电极施加所述电压，采集参比电极和工作电极两端的电压，并将采集的电压值发送至主机，所述主机将采集卡采集的电压值与预设电压值进行对比，并根据对比结果控制所述采集卡调整向工作电极和所述对电极发送电压信号。4.根据权利要求2或3所述的基于电化学发光的单分子检测方法，其特征在于，所述的所述的电化学反应物中还包括游离的探针分子用于参与电化学发光反应中的催化路径以增强共反应剂路径产生的电化学信号。5.根据权利要求1或2或3所述的基于电化学发光的单分子检测方法，其特征在于，所述的光子信号采集体系通过光子信息采集单元和主机来实现，所述的光子信息采集单元包括显微成像系统和光子探测器；显微成像系统设置在所述样品池正下方的位置，并与光子探测器连接，光子探测器的另一端与主机连接。6.根据权利要求5所述的基于电化学发光的单分子检测方法，其特征在于，所述光子探测器用于连续采集样品池中释放的孤立光子信号，并依次将其发送至主机，所述主机根据所述光子探测器发送的孤立光子信号生成用于分析处理的灰度图像。7.根据权利要求6所述的基于电化学发光的单分子检测方法，其特征在于，在时间和空间上...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯建东，朱文鑫，董金润，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：