一种用于进化纳米抗体的人工半生命体蛋白粒及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开一种用于进化纳米抗体的人工半生命体蛋白粒及其制备方法与应用，属于合成生物学和基因工程技术领域。发明专利技术为解决能在大肠杆菌中被拯救的半生命体的问题，它是一个遗传信息核酸与表型蛋白的统一体，类同病毒和噬菌体等天然生命体。蛋白粒的核酸以环状质粒为骨架，包括的元件有：(1)DNA结合蛋白的基因序列，(2)能与DNA结合蛋白互作的基因序列，以及(3)表达功能性蛋白如纳米抗体的基因序列。这个半生命体进一步还能利用宿主大肠杆菌实现复制扩增，如同噬菌体一样。本发明专利技术也展示了蛋白粒用于进化纳米抗体，提高亲和力的应用和方法，比经典的定向进化技术更具优势。比经典的定向进化技术更具优势。比经典的定向进化技术更具优势。

【技术实现步骤摘要】
一种用于进化纳米抗体的人工半生命体蛋白粒及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于合成生物学和基因工程
，具体涉及一种用于进化纳米抗体的人工半生命体蛋白粒及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]新生命体的设计与构建是一个令人兴奋的合成生物学研究内容，因为人类可以利用各种生命体包括诸多微生物而实现广泛的应用。例如，各种展示技术就是利用包括噬菌体、酵母、细菌等微生物而实现对抗体等生物分子的高通量筛选的。此外，定向进化技术也是借助于微生物，在实验室里模拟达尔文进化过程，实现人工的，对于蛋白质或者酶的快速进化，在较短的时间内实现自然界上万年才能实现的进化过程。
[0003]目前已经有不少的纳米抗体筛选技术，例如从一个纳米抗体的噬菌体库中筛选出具有高亲和力的纳米抗体。与之相反，对于筛选之后的纳米抗体做进化以进一步提高亲和力的例子还较少。此外，DNA展示技术尚未由于自生的缺陷，尚未能应用于对纳米抗体的进化。而噬菌体展示等技术主要处于筛选层面，不涉及进化。因此发展进化纳米抗体的新方法也是一项亟待开发的技术。
[0004]经典的定向进化技术中一般通过挑取单个菌落进行功能和基因型的鉴定。因为基因型和表型蛋白(酶)是分开的，其活性和功能的鉴定需要对单个突变体进行测定，工作量极大，也未能应用于纳米抗体的进化。为了解决这个难题，本专利技术还利用蛋白粒这个半生命体，设计了一个进化流程，进而实现了对纳米抗体的进化。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是设计能够在大肠杆菌中被自我拯救的半生命体，以及用此半生命体来进化纳米抗体。
[0006]本专利技术提供一种人工半生命体蛋白粒，所述人工半生命体是一个遗传物质核酸与其编码表型蛋白自组装的复合体，人工半生命体在宿主中被复制。
[0007]进一步地限定，所述遗传物质核酸是以一个环状质粒为基本骨架，插入数个基因元件，宿主是原核生物细胞。
[0008]进一步地限定，其中一个基因元件能够表达DNA结合蛋白。
[0009]进一步地限定，一个基因元件能被DNA结合蛋白识别，所述基因元件是单次重复或多次重复。
[0010]进一步地限定，基本骨架为pET系列蛋白表达质粒。
[0011]进一步地限定，数个基因元件依次排序如下：单次或多次重复的DNA binding motif，T7 promoter,Lac operator,ribosome binding site，coding sequence，T7 terminator。
[0012]进一步地限定，所述coding sequence含有能识别DNA binding motif的DNA结合
蛋白的基因序列和纳米抗体基因序列。
[0013]进一步地限定，DNA binding motif是MAFB motif；DNA结合蛋白是MAFB binding domain；coding sequence还含有mCherry基因序列和His
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tag基因序列。
[0014]本专利技术提供上述的人工半生命体蛋白粒在进化纳米抗体中的应用。
[0015]本专利技术提供一种进化纳米抗体的方法，所述方法的步骤如下：
[0016]步骤1，基因多样化：将待进化的纳米抗体的CDR区域进行突变，插入人工半生命体蛋白粒的人工半生命体蛋白粒中，使纳米抗体的编码基因多样化，获得基因突变文库；
[0017]步骤2，蛋白粒拯救和筛选：将步骤1获得的突变文库用大肠杆菌转化后进行蛋白表达纯化实现蛋白粒的拯救，然后用包被了抗原的柱子亲和纯化实现对蛋白粒筛选；
[0018]步骤3，鉴定筛选后的纳米抗体：利用扩增纳米抗体基因的引物，以步骤2获得的筛选后的蛋白粒为模板进行PCR扩增，获得的扩增的纳米抗体的基因插入到载体中，测序鉴定突变结果，进行转染进而在细胞层面鉴定进化后的纳米抗体，或者蛋白纯化表达后进而在生化层面表征进化后的纳米抗体。
[0019]进一步地限定，步骤1中CDR3区域进行突变，采取单点饱和突变建库、双点饱和突变建库或者多点饱和突变建库的方法。
[0020]进一步地限定，步骤3中测序鉴定结果中出现两次及以上重复的突变质粒，细胞层面的转染用mCherry
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C1为载体，生化层面的表达可以用pET系列载体。
[0021]有益效果：本专利技术技术的本质是将新生命体的设计合成、展示筛选技术、以及定向进化技术三者合一而实现的。该专利技术公开了一种叫做蛋白粒Proteinomid的人工半生命体，它是由表型蛋白部分(protein)和基因型质粒(plasmid)所组成，因而被命名为蛋白粒Proteinomid，其特征在于表型蛋白部分正好是其遗传信息基因的直接产物，因此该蛋白粒与普通的蛋白质—DNA复合物具有本质的不同。蛋白粒就像其它微生物一样，携带了自身的遗传物质DNA以及蛋白质，可以在侵染其它宿主后，例如细菌后而得到拯救(图1)。
[0022]基于蛋白粒，本专利技术还公开了用蛋白粒来进化纳米抗体的应用，对于抗体进化使之具有更高结合能力等特征是一个具有重大价值的应用。使用蛋白粒技术，能够通过一锅法而筛选出被进化的纳米抗体，极大地减少了定向进化的工作量。
[0023]此外，将蛋白粒定向进化技术与噬菌体天然库筛选技术相结合，可以大大增加天然库的使用价值，使这种更为快速的，经济的纳米抗体天然噬菌体库的价值得到充分发挥，并且仍然可以得到更有较高结合能力的纳米抗体。在本专利技术中，我们公布了用优选的蛋白粒载体来进化两种噬菌体筛选后的纳米抗体，均取得成功，得到了结合力更强，乃至结合特性改造后的纳米抗体。
附图说明
[0024]图1：人造半生命体—蛋白粒的结构示意图，以及与之相关的微生物(噬菌体和病毒)的结构示意图。
[0025]图2：不含纳米抗体版本的蛋白粒的基因元件和相应的DNA序列。
[0026]图3：含了G6纳米抗体版本的蛋白粒的基因元件和相应的DNA序列。
[0027]图4：利用蛋白粒实现对G6纳米抗体进化的流程示意图。
[0028]图5：G6纳米抗体的R112K113位点双点饱和突变所使用的引物列表和F12纳米抗体
CDR3区域101
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112位点的单点NNK饱和突变所使用的引物列表。
[0029]图6：G6纳米抗体的R112K113位点双点饱和突变的9组突变的突变后的多样性验证测序结果图，以及相应的用于蛋白表达的组别分配图。
[0030]图7：荧光共振能量转移(FRET)光谱图，用于初步分析所进化出的纳米抗体与抗原hTPX2
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EGFP的结合力相对大小。纵坐标为荧光强度(a.u.)，横坐标为波长(nm)。
[0031]图8：TBPg6和进化得到的TBPg6(KV)的等温滴定量热法ITC分析的Wiseman
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Plot曲线，以及拟合出来的相应的K值，其中左侧是TBPg6的ITC曲线，右侧是TBPg6(KV)的曲线。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人工半生命体蛋白粒，其特征在于，所述人工半生命体是一个遗传物质核酸与其编码表型蛋白自组装的复合体，人工半生命体在宿主中被复制。2.根据权利要求1所述的人工半生命体蛋白粒，其特征在于，所述遗传物质核酸是以一个环状质粒为基本骨架，插入数个基因元件，宿主是原核生物细胞。3.根据权利要求2所述的人工半生命体蛋白粒，其特征在于，所述数个基因元件的其中一个基因元件能够表达DNA结合蛋白。4.根据权利要求2所述的人工半生命体蛋白粒，其特征在于，一个基因元件能被DNA结合蛋白识别，所述基因元件是单次重复或多次重复。5.根据权利要求2所述的人工半生命体蛋白粒，其特征在于，基本骨架为pET系列蛋白表达质粒。6.根据权利要求2所述的人工半生命体蛋白粒，其特征在于，数个基因元件依次排序如下：单次或多次重复的DNA binding motif，T7 promoter,Lac operator,ribosome binding site，coding sequence，T7 terminator。7.根据权利要求6所述的人工半生命体蛋白粒，其特征在于，所述coding sequence含有能识别DNA binding motif的DNA结合蛋白的基因序列和纳米抗体基因序列。8.根据权利要求7所述人工半生命体蛋白粒，其特征在于，DNA binding motif是MAFB motif；DNA结合蛋白是MAFB bindi...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈西，
申请(专利权)人：哈尔滨工业大学，
类型：发明
国别省市：