三维核酸纳米材料及其制备方法和在干细胞治疗中的应用技术

本申请属于生物医药技术领域，尤其涉及三维核酸纳米材料及其制备方法和在干细胞治疗中的应用。本申请提供了三维核酸纳米材料，DNA四面体载体；通过6条单链构建功能性DNA四面体基因递送系统，负载有肝脏特异性miRNA后作为治疗急性肝功能衰竭药物。本申请提供了三维核酸纳米材料及其制备方法和在干细胞治疗中的应用，可通过DNA四面体基因递送系统，诱导hADMSCs向成熟肝细胞样细胞分化，采用干细胞肝分化路线治疗ALF。肝分化路线治疗ALF。肝分化路线治疗ALF。

【技术实现步骤摘要】
三维核酸纳米材料及其制备方法和在干细胞治疗中的应用


[0001]本申请属于生物医药
，尤其涉及三维核酸纳米材料及其制备方法和在干细胞治疗中的应用。

技术介绍

[0002]化学药物、病毒、肝硬化、肝炎及脂肪性肝病都可引起肝损伤，其中急性肝功能衰竭(Acuteliver failure，ALF)是指一组严重的临床症状，会在较短的时间内迅速出现昏迷，常因并发心肺功能衰竭、肾功能衰竭、胃肠道出血和败血症而死亡，病死率可高达80％
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90％。目前ALF的治疗方法包括药物治疗和人工肝支持，但都疗效有限，且费用昂贵。肝移植是目前唯一有效的ALF治疗手段，但肝脏移植存在供体短缺、手术风险高、费用高、移植后免疫排斥、需要终身使用免疫抑制剂及生活质量差等诸多局限性和风险等问题。目前以干细胞和肝细胞样细胞为基础的细胞移植疗法为ALF及相关肝脏疾病的治疗带来了希望。
[0003]干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，在未充分分化时，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。在个体发育的不同阶段以及成体的不同组织中均存在着干细胞，如胚胎干细胞(EC)、神经干细胞(NSC)、成体干细胞(ASC)、诱导多能干细胞(iPS)等。间充质干细胞(MSC)来源于中胚层，属于多能干细胞，根据来源分为骨髓间充质干细胞(BMSCs)、脐带间充质干细胞(UCMSCs)、脂肪间充质干细胞(ADMSCs)等。然而，BMSCs的获得是一个侵袭性的过程，而且产量通常很低。UCMSCs具有低免疫原性和低排斥反应，分离UCMSCs对母体和胎儿无损伤。
[0004]然而，UCMSCs分离在技术上是有挑战性的，同种异体脐血间充质干细胞对受者具有致瘤风险，因为这些移植细胞逃避了供体的免疫监视。与其他来源的间充质干细胞相比，ADMSCs具有产量高、增殖能力强、低免疫原性和免疫调节等优点，是一种很有前途的MSCs来源干细胞，其移植在许多致命疾病的治疗方面显示出巨大的潜力，包括急性心肌梗死、急性呼吸窘迫综合征、急性肾损伤和急性缺血性中风。因此，利用ADMSCs分化为功能性肝细胞在肝脏疾病细胞治疗和肝脏再生中具有巨大潜力和应用前景。
[0005]虽然ADMSCs具有自我更新、高增殖和多向分化的能力，但高效控制ADMSCs分化方向和具体过程尚不成熟，特别是诱导ADMSCs在分化效率、均一性功能性和安全性等方面离临床应用还有很大的距离。传统的干细胞分化诱导过程通常需要大量的时间和蛋白诱导因子来产生肝细胞样细胞，效率低且很难进行大规模的生产应用。因此，如何在体内高效经济地促使人ADMSCs(hADMSCs)转化为具有肝功能的成熟肝细胞，从而挽救肝衰竭(ALF)仍是一个有待解决的问题。除此之外，血液和ALF部位中活性氧(ROS)升高将严重削弱和损伤干细胞。因此，为了逆转ROS抑制，调节细胞外ROS的水平也对细胞治疗至关重要。
[0006]目前纳米材料作为递送载体为基于干细胞治疗的精准治疗打开了新的方向，弥补了单一治疗存在的不足与缺陷。众所周知，大多数硬纳米材料，如金、银、铜和锰等纳米粒子具有积累毒效应且不易生物降解，在临床治疗中这些纳米材料将具有产生不良反应的潜在影响，而且复杂的材料合成也将限制这些纳米材料的大规模应用。
[0007]综上所述，传统的原代干细胞肝分化过程通常需要大量的时间和蛋白诱导因子来产生肝细胞样细胞，且效率低；常见的碳纳米材料、量子点和脂质体纳米粒子等无机和有机纳米材料合成过程复杂，且不易生物降解和具有积累毒效应，将限制其大规模应用，特别是在临床治疗中将产生不可预测的不良反应。

技术实现思路

[0008]有鉴于此，本申请提供了三维核酸纳米材料及其制备方法和在干细胞治疗中的应用，可通过DNA四面体基因递送系统，诱导hADMSCs向成熟肝细胞样细胞分化，采用干细胞肝分化路线治疗ALF。
[0009]本申请第一方面提供了三维核酸纳米材料，包括：
[0010]6条单链构建的DNA四面体载体；
[0011]其中，所述DNA四面体载体具有Seq ID NO.1、Seq ID NO.2、Seq ID NO.3、Seq ID NO.4、Seq ID NO.5和Seq ID NO.6所示核苷酸序列；所述Seq ID NO.1单链、所述Seq ID NO.2单链、所述Seq ID NO.3单链、所述Seq ID NO.4单链、所述Seq ID NO.5单链和所述Seq ID NO.6单链相互连接形成DNA四面体结构；
[0012]所述Seq ID NO.1、所述Seq ID NO.2、所述Seq ID NO.3、所述Seq ID NO.4、所述Seq ID NO.5或所述Seq ID NO.6中的一条或多条的末端连接有第一接头。
[0013]具体的，本申请提供的三维核酸纳米材料可通过第一接头互补连接不同的核酸药物，形成DNA四面体基因递送系统，本申请的DNA四面体载体可与不同的核酸药物连接(核酸药物序列不能与DNA四面体序列相互配对，减少可能的非特异杂交配对)，在体内定向递送不同的药物。
[0014]具体的，所述DNA四面体的核酸序列不能与核酸药物的核酸序列相互配对，使得所述核酸药物发生非特异杂交配对。
[0015]另一实施例中，所述DNA四面体载体还包括荧光染料，所述荧光染料修饰在所述DNA四面体载体任一条所示核苷酸序列上。
[0016]另一实施例中，所述荧光染料选自FAM、Cy5、Cy7、AlexaFluor488、AMCA、Cy3、Cy5.5、Quasar670、TAMRA和TexasRed中的一种或多种。
[0017]具体的，所述荧光染料修饰在所述DNA四面体载体任一条所示核苷酸序列的5
’
端。
[0018]本申请第二方面提供了三维核酸纳米材料的制备方法，包括：
[0019]将Seq ID NO.1单链、Seq ID NO.2单链、Seq ID NO.3单链、Seq ID NO.4单链、Seq ID NO.5单链和Seq ID NO.6单链与缓冲液混合，进行退火反应，得到DNA四面体载体。
[0020]本申请第三方面公开了所述三维核酸纳米材料或所述制备方法制得的三维核酸纳米材料在制备治疗急性肝功能衰竭药物中的应用。
[0021]本申请第四方面提供了一种治疗急性肝功能衰竭药物，包括：
[0022]DNA四面体载体和肝脏特异性miRNA；
[0023]所述DNA四面体载体具有Seq ID NO.1、Seq ID NO.2、Seq ID NO.3、Seq ID NO.4、Seq ID NO.5和Seq ID NO.6所示核苷酸序列；
[0024]所述Seq ID NO.1、所述Seq ID NO.2、所述Seq ID NO.3、所述Seq ID NO.4、所述Seq ID NO.5或所述Seq ID NO.6中的一条或多条的末端连接有第一接头；
[0025]所述肝脏特本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.三维核酸纳米材料，其特征在于，包括：6条单链构建的DNA四面体载体；其中，所述DNA四面体载体具有Seq ID NO.1、Seq ID NO.2、Seq ID NO.3、Seq ID NO.4、Seq ID NO.5和Seq ID NO.6所示核苷酸序列；所述Seq ID NO.1单链、所述Seq ID NO.2单链、所述Seq ID NO.3单链、所述Seq ID NO.4单链、所述Seq ID NO.5单链和所述Seq ID NO.6单链相互连接形成DNA四面体结构；所述Seq ID NO.1、所述Seq ID NO.2、所述Seq ID NO.3、所述Seq ID NO.4、所述Seq ID NO.5或所述Seq ID NO.6中的一条或多条的末端连接有第一接头。2.根据权利要求1所述的三维核酸纳米材料，其特征在于，所述DNA四面体载体还包括荧光染料，所述荧光染料修饰在所述DNA四面体载体任一条所示核苷酸序列上。3.根据权利要求1所述的三维核酸纳米材料，其特征在于，所述荧光染料选自FAM、Cy5、Cy7、AlexaFluor488、AMCA、Cy3、Cy5.5、Quasar670、TAMRA和TexasRed中的一种或多种。4.三维核酸纳米材料的制备方法，其特征在于，包括：将Seq ID NO.1单链、Seq ID NO.2单链、Seq ID NO.3单链、Seq ID NO.4单链、Seq ID NO.5单链和Seq ID NO.6单链与缓冲液混合，进行退火反应，得到DNA四面体载体。5.权利要求1～3任意一项所述的三维核酸纳米材料或权利要求4所述的制备方法制得的三维核酸纳米材料在制备治疗急性肝功能衰竭药物中的应用。6.一种治疗急性肝功能衰竭药物，其特征在于，包括：DNA四面体载体和肝脏特异性miRNA；所述DNA四面体载体具有Seq ID NO.1、Seq ID NO.2、Seq ID NO.3、Seq ID NO.4、Seq ID NO.5和Seq ID NO.6所示核苷酸序列；所述Seq ID NO.1、所述Seq ID NO.2、所述Seq ID NO.3、所述Seq ID NO.4、所述Seq ID NO.5或所述Seq ID NO.6中的一条或多条的末端连接有第一接头；所述肝脏特异性miRNA的末端连接有第二接头；所述第一接头的序列与所述第二接头的序列互补配对；所述Seq ID NO.1单链、所述Seq I...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶玉，魏红岩，李芬芳，李明强，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：