一种利用终止子中插入DNA指纹序列快速检测转基因拷贝数的方法技术

本发明专利技术涉及基因检测技术领域，尤其涉及一种利用终止子中插入DNA指纹序列快速检测转基因拷贝数的方法。本发明专利技术所述方法基于内源终止子序列和插入有DNA指纹序列的转基因终止子序列间差异，利用共用引物对，在同一qPCR反应体系中扩增得到转基因终止子序列和内源终止子序列，进而通过分析其熔解曲线，根据二者熔解峰的荧光强度比值，能准确定量并快速检测转基因生物目的基因拷贝数。该DNA指纹序列的插入不影响基因在转基因生物体内正常表达，该方法具有检测灵敏度高、结果准确性高、检测效率高、成本低、检测周期短等优点。检测周期短等优点。检测周期短等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种利用终止子中插入DNA指纹序列快速检测转基因拷贝数的方法


[0001]本专利技术涉及基因检测
，尤其涉及一种利用终止子中插入DNA指纹序列快速检测转基因拷贝数的方法。

技术介绍

[0002]随着分子生物技术快速发展，特别是转基因技术的出现，给植物育种带来新的技术手段。转基因拷贝数是影响目的基因表达水平和遗传稳定性的重要因素，因此，检测转入目标基因的拷贝数是转基因研究中关键的一步。
[0003]目前应用于拷贝数变异检测的技术主要有：比较基因组杂交技术(comparative genome hybridization,CGH)、TaqMan荧光探针技术、变性高效液相色谱(denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC)技术、多重连接探针扩增技术(multiplex ligation
‑
dependent probe amplification,MLPA)和新一代测序技术等。尽管这些技术应用广泛，但其缺陷依旧明显：CGH技术分辨率在Mb水平，更小片段的拷贝数片段则不易检出，同时该技术操作繁琐，通量低、耗时长且成本昂贵，需要较为大量的模板DNA，不利于大范围的推广；TaqMan荧光探针合成原料成本高、获取难度大，且通常无法克服信噪比低的缺陷，实验数据可重复性差；DHPLC技术在实践应用中，分辨力常受到实验设计、检测环境等因素的影响，存在可靠性和稳定性欠佳的问题；MLPA技术操作复杂，且需要毛细管电泳进行产物分析，整个实验耗时过长；新一代测序技术适合大样本的检测，但其依托的测序平台价格昂贵，且需要专业实验操作和数据分析人员，不适宜在普通实验室、基层医院或医学检验所开展。
[0004]实时荧光定量PCR技术(quantitative real
‑
time PCR，qPCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量，通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。常规qPCR用于拷贝数分析时，需要至少两对引物，一对引物用于扩增目的基因，一对引物用于扩增内参基因(一般选取基因组中的单拷贝基因)，通过扩增效率和Ct值计算各自的表达量并转换成相对定量或绝对定量，最终通过目的基因的量与内参基因的量的比值计算得出目的基因的拷贝数。该方法最常见的问题有：两对引物扩增效率不一致；每次实验都需检测扩增效率或固定扩增效率但批次之间会有差异；目的基因检测与内参基因检测在不同样品孔中，不同反应体系中操作中的微小差异容易导致定量变化。由于qPCR的灵敏度较高，上述微小差异最终可能导致计算所得的定量值偏离实际较远，故常规qPCR在鉴定拷贝数时存在较大的误差。

技术实现思路

[0005]有鉴于
技术介绍
中存在的技术问题，本专利技术的目的是提供一种基于实时荧光定量PCR熔解曲线法的转基因植株目的基因拷贝数检测方法，所述方法在内源终止子序列中加入一段DNA指纹序列(DFP)用于拷贝数检测，具有检测灵敏度高、结果准确性高、检测效率高
及检测成本低等优点。
[0006]具体的，本专利技术的技术方案如下：
[0007]第一方面，本专利技术提供了一种转基因生物目的基因拷贝数检测方法，包括如下步骤：
[0008]S1、在内源终止子序列中插入DNA指纹序列，得到转基因终止子序列；所述DNA指纹序列大于10bp；
[0009]基于所述转基因终止子序列，在所述DNA指纹序列的两侧设计共用引物对；
[0010]S2、以转基因生物为待测样品；
[0011]使用步骤S1所述共用引物对，以待测样品的基因组DNA为模板，或者，分别以待测样品的基因组DNA和对照野生型样品的基因组DNA为模板，进行qPCR，得到PCR产物；
[0012]S3、分析步骤S2所述PCR产物的熔解曲线，根据转基因终止子序列熔解峰和内源终止子序列熔解峰的荧光强度比值，判定转基因生物目的基因拷贝数；
[0013]所述转基因终止子序列熔解峰和内源终止子序列熔解峰由待测转基因样品的基因组DNA扩增产物熔解得到；
[0014]所述转基因终止子序列熔解峰和内源终止子序列熔解峰对应的温度差值≥1℃。
[0015]转基因生物中含有基因表达盒，所述基因表达盒包括启动子、基因编码区和终止子等元件；所述终止子元件来源于植物内源序列，该终止子元件插入有DNA指纹序列；当该基因表达盒在转基因生物体内正常表达时，以该转基因生物的基因组DNA为模板，利用转基因终止子序列和内源终止子序列的共用引物对，能在同一qPCR反应体系中扩增得到两种存在结构性差异的PCR产物。进而，通过分析所述PCR产物的熔解曲线，根据转基因终止子序列熔解峰和内源终止子序列熔解峰的荧光强度比值，能准确定量转基因生物目的基因拷贝数，且具有检测灵敏度高、结果准确性高、检测效率高、成本低、检测周期短等优点。
[0016]在本专利技术中，所述内源序列是指该转基因生物对应的野生型生物自身所拥有的、可实现自我复制的内源基因。
[0017]本专利技术通过在内源终止子序列中插入DNA指纹序列的方式，使转基因终止子序列和内源终止子序列形成结构差异。
[0018]本专利技术基于所述转基因终止子序列(即插入有DNA指纹序列的内源终止子序列)，在所述DNA指纹序列的两侧设计共用引物对；然后以转基因生物为待测样品，以待测样品的基因组DNA为模板，利用所述共用引物对，对转基因终止子序列和内源终止子序列进行扩增，进而扩增得到两种具有结构性差异(大小不同、GC比例不同、含量不同)的PCR产物。
[0019]本专利技术对PCR扩增产物进行熔解曲线分析，基于转基因终止子序列和内源终止子序列扩增产物的结构性差异，可在熔解曲线中呈现两个单一可区分的熔解峰。
[0020]在本专利技术中，当转基因终止子序列熔解峰和内源终止子序列熔解峰对应的温度差值≥1℃时，可基于转基因终止子序列熔解峰和内源终止子序列熔解峰对应的荧光强度(和扩增产物含量相关)比值，实现针对该转基因生物目的基因拷贝数的快速判定和准确定量。
[0021]在本专利技术中，步骤S1所述DNA指纹序列及共用引物对的设计原则优选包括：使转基因终止子序列与内源终止子序列的扩增产物因GC含量的差异而在待测样品中呈现两个单一可区分的熔解峰。
[0022]在本专利技术中，步骤S2在进行qPCR时，可以只以待测转基因样品的基因组DNA为模
板，也可以分别以待测转基因样品的基因组DNA和对照野生型样品的基因组DNA为模板。当分别以待测转基因样品的基因组DNA和对照野生型样品的基因组DNA为模板时，待测转基因样品的基因组DNA的扩增产物中既含有内源终止子序列，又含有转基因终止子序列；而野生型样本的基因组DNA扩增产物中只含有内源终止子序列。野生型样本的基因组DNA扩增产物可用于对照实验。
[0023]在本专利技术中，步骤S3所述熔解曲线的获取方法优选包括：把qPCR法扩增后的PCR产物缓慢升温至本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.转基因生物目的基因拷贝数检测方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、在内源终止子序列中插入DNA指纹序列，得到转基因终止子序列；所述DNA指纹序列大于10bp；基于所述转基因终止子序列，在所述DNA指纹序列的两侧设计共用引物对；S2、以转基因生物为待测样品；使用步骤S1所述共用引物对，以待测样品的基因组DNA为模板，或者，分别以待测样品的基因组DNA和对照野生型样品的基因组DNA为模板，进行qPCR，得到PCR产物；S3、分析步骤S2所述PCR产物的熔解曲线，根据转基因终止子序列熔解峰和内源终止子序列熔解峰的荧光强度比值，判定转基因生物目的基因拷贝数；所述转基因终止子序列熔解峰和内源终止子序列熔解峰由待测转基因样品的基因组DNA扩增产物熔解得到；所述转基因终止子序列熔解峰和内源终止子序列熔解峰对应的温度差值≥1℃。2.根据权利要求1所述转基因生物目的基因拷贝数检测方法，其特征在于，转基因生物目的基因拷贝数＝K
×
(转基因终止子序列熔解峰荧光值/内源终止子序列熔解峰荧光值)，K为常数。3.根据权利要求1或2所述转基因生物目的基因拷贝数检测方法，其特征在于，所述内源终止子序列选择水稻ALS基因终止子OsALSTer。4.根据权利要求1
‑
3所述转基因生物目的基因拷贝数检测方法，其特征在于，所述内源终止子序列如SEQ ID NO.1所示；所述转基因终止子序列如SEQ ID NO.2所示。5.根据权利要求1
‑
3所述转基因生物目的基因拷贝数检测方法，其特征在于，所述DNA指纹序列如SEQ ID NO.3所示。6.根据权利要求3
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5任意一项所述转基因生物目的基因拷贝数检测方法，其特征在于，若转基因终止子序列熔解峰缺失，仅存在内源终止子序列熔解峰，则所述转基因生物目的基因拷贝数为0；若转基因终止子序列熔解峰荧光值/内源终止子序列熔解峰荧光值为0.25
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0.8...

【专利技术属性】
技术研发人员：安保光，赵光苗，金雄霞，李应将，欧阳超，王健华，
申请(专利权)人：海南波莲科技有限公司，
类型：发明
国别省市：