【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物分子育种，尤其涉及一种通过crispr-cas9基因编辑创制番茄雄性不育材料的方法及应用。
技术介绍
1、番茄是世界上重要的蔬菜作物之一，在各国的蔬菜栽培中均占有相当的比例。番茄的适应性强、产量高、营养(尤其是维生素和糖分)丰富且用途广泛(生食、菜用和加工)，具有7项主要育种目标和丰富种质资源，在生理生化、遗传及分子生物学等方面得到了广泛、深入、系统的研究。番茄的杂种优势(三性、一势、一度)表现十分明显，其品种“杂优化”已成为当代番茄育种的主要潮流，因此，应用和推广杂交番茄是提高番茄产量的一个重要途径。
2、而且对于番茄来说，人工去雄过程繁琐，番茄的人工去雄授粉制种技术是一项劳动密集型和技术密集型的工作，存在很多弊端：一是对制种工人的技术要求高，制种工人必须准确判断开花状态，一旦去雄不彻底，就会人为造成假杂种，因此，制种工人不仅技术熟练程度高，而且还要具备高度责任心；二是杂交种子产量低，一般仅为150～300kg/hm2，其结籽数仅为自然结籽数的70％～80％；三是制种成本高，制种过程既包括去雄、授粉、标记等关键制种技术，也有一般农事操作和田间管理(如整枝打杈、施肥浇水及病虫草害的防治等)，1个熟练工人1d可操作400～600株，制种用工为90～120人/hm2。由此可见，这种费工、费时、低效、高成本的制种技术完全不能满足现代高效农业对种子的需求。
3、因此，雄性不育株系的选育是解决该问题的根本途径，同时也是保证品种纯度的有效措施。然而，将雄性不育性状导入所需要的亲本材料中形成新的不育系
4、目前，crispr/cas9系统已在水稻(barman et al.,2019)、小麦(okada et al.,2019)、玉米(qi et al.,2020)、高粱(cigan et al.,2017)、苜蓿(ye et al.,2022)等作物中获得了相应的雄性不育系，展现出其在生物育种中的巨大潜力。因此，通过对雄蕊发育基因的定向突变，可以实现在优异番茄育种材料中产生雄性不育系。
5、与模式植物拟南芥和模式作物水稻相比，番茄中已克隆和鉴定的gms基因和创制的雄性不育材料均相对较少。crispr/cas9(clustered,regularly interspaced,shortpalindromic repeats associated endonuclease 9)基因编辑技术由于具有成本低廉、操作简易和突变诱导率高等特点，被越来越广泛地应用于植物基因功能研究，作物遗传改良和育种等多个方面，应用前景十分广阔。
6、利用crispr/cas9技术挖掘鉴定番茄雄性不育候选基因和创制雄性不育材料，可以快速丰富番茄gms基因和不育材料资源，从而促进番茄不育化育种和制种的推广和应用，最终可以有效解决番茄种业行业长期面临缺乏稳定的番茄不育系和突破性大品种的瓶颈问题。
技术实现思路
1、本专利技术提供一种通过crispr-cas9基因编辑创制番茄雄性不育材料的方法及应用，具体地，本专利技术提供雄性不育基因slfac及其突变体slfac在创制番茄雄性不育系中的应用。
2、第一方面，本专利技术提供slfac基因在控制番茄雄性生殖发育中的应用，所述slfac基因编码蛋白的氨基酸序列为以下任一：
3、1)所述氨基酸序列如seq id no.2所示；
4、2)所述氨基酸序列为将seq id no.2经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有调控植物雄性育性活性的氨基酸序列。
5、在本专利技术提供的slfac基因在控制番茄雄性生殖发育中的应用，所述slfac基因的核苷酸序列为seq id no.1所示。
6、第二方面，本专利技术提供一种创制番茄雄性不育系的方法，在番茄植株中抑制slfac基因的表达和/或活性。
7、在本专利技术提供的创制番茄雄性不育系的方法中，利用crispr/cas9基因编辑来抑制slfac基因的表达和/或活性。所述crispr/cas9基因编辑包括：在所述slfac基因第1外显子处设计crispr/cas9载体靶点，所述靶点的dna序列如seq id no.3所示。
8、本专利技术提供一种抑制剂，抑制slfac基因的表达活性，所述抑制剂选自crispr/cas9、shrna、sirna、dsrna、mirna、cdna、反义rna/dna、低分子化合物、肽、抗体中的至少一种。
9、具体地，第三方面，本专利技术提供一种适用于crispr/cas9系统的靶位点，基于crispr/cas9系统对所述slfac基因进行定向敲除，抑制slfac基因的表达活性；
10、优选地，所述靶位点包括：如seq id no.3所示的靶位点：tggtgccttatggtcagcca。
11、第四方面，本专利技术提供一种crispr/cas9系统打靶载体，含有特异性靶向上述靶位点的sgrna。
12、第五方面，本专利技术提供slfac突变基因，所述突变基因为野生型slfac外显子任意碱基突变造成氨基酸变异和/或蛋白功能异常从而造成雄性不育表型的核苷酸突变类型。
13、第六方面，本专利技术提供突变体slfac，所述突变体slfac为野生型slfac基因自起始密码子atg开始第242位碱基至243位碱基ag的缺失，序列如seq id no.4所示。
14、第七方面，本专利技术提供一种获得slfac雄性不育系的方法，包括：以上述方法获得的番茄雄性不育系或含有上述突变体slfac的番茄雄性不育系作为亲本，与目标材料进行杂交，获得的f1代与目标材料进行回交，从而使回交后代获得与所述番茄雄性不育系相同的性状和基因突变；
15、优选地，所述番茄雄性不育系中slfac基因的核苷酸序列如seq id no.4所示。
16、根据本领域技术人员的理解，本专利技术提供了上述靶位点或上述的crispr/cas9系统打靶载体或上述的slfac突变体在以下任一项中的应用：
17、(1)在调控番茄雄性育性性状中的应用；
18、(2)在番茄杂交育种和制种中的应用；
19、(3)番茄不育系的选育或种质资源改良中的应用。
20、所述的杂交育种和制种是指将slfac雄性不育系作为母本与其他父本进行杂交；包括将获得的slfac雄性不育系与其他目标材料进行杂交，获得f1代后，与目标材料进行回交，从而使目标材料获得slfac雄性不育的性状和基因突变。
21、所述改良包括提高作物产量、提高作物品质、提高作物抗病虫害、抗逆、抗倒伏能力。
22、本专利技术的有益本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.SlFAC基因在控制番茄雄性生殖发育中的应用，其特征在于，所述SlFAC基因编码蛋白的氨基酸序列为以下任一：
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述SlFAC基因的核苷酸序列为SEQ IDNO.1所示。
3.一种创制番茄雄性不育系的方法，其特征在于，在番茄植株中抑制SlFAC基因的表达和/或活性。
4.根据权利要求3所述创制番茄雄性不育系的方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9基因编辑来抑制SlFAC基因的表达和/或活性。
5.一种适用于CRISPR/Cas9系统的靶位点，其特征在于，基于CRISPR/Cas9系统对所述SlFAC基因进行定向敲除，抑制SlFAC基因的表达活性；
6.一种CRISPR/Cas9系统打靶载体，其特征在于，含有特异性靶向权利要求5所述靶位点的sgRNA。
7.SlFAC突变基因，其特征在于，所述突变基因为野生型SlFAC外显子任意碱基突变造成氨基酸变异和/或蛋白功能异常从而造成雄性不育表型的核苷酸突变类型。
8.突变体slfac，其特征在于，为野生型S
9.一种获得SlFAC雄性不育系的方法，其特征在于，包括：以权利要求3-4任一项所述方法获得的番茄雄性不育系或含有权利要求8所述突变体slfac的番茄雄性不育系作为亲本，与目标材料进行杂交，获得的F1代与所述目标材料进行回交，从而使回交后代获得与所述番茄雄性不育系相同的性状和基因突变；
10.权利要求5所述靶位点或权利要求6所述的CRISPR/Cas9系统打靶载体或权利要求8所述的slfac突变体在以下任一项中的应用：
...【技术特征摘要】
1.slfac基因在控制番茄雄性生殖发育中的应用，其特征在于，所述slfac基因编码蛋白的氨基酸序列为以下任一：
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述slfac基因的核苷酸序列为seq idno.1所示。
3.一种创制番茄雄性不育系的方法，其特征在于，在番茄植株中抑制slfac基因的表达和/或活性。
4.根据权利要求3所述创制番茄雄性不育系的方法，其特征在于，利用crispr/cas9基因编辑来抑制slfac基因的表达和/或活性。
5.一种适用于crispr/cas9系统的靶位点，其特征在于，基于crispr/cas9系统对所述slfac基因进行定向敲除，抑制slfac基因的表达活性；
6.一种crispr/cas9系统打靶载体，其特征在于，含有特异性靶向权利要求5所述靶位点的sgrna。
...【专利技术属性】
技术研发人员：唐杰，李新鹏，吴春瑜，刘昊，安保光，韩晓斌，
申请(专利权)人：海南波莲科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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