【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及农业生物，尤其涉及植物als突变基因、其编码蛋白以及抗als抑制剂类除草剂植物的制备方法。
技术介绍
1、乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase，als；ec2.2.1.6)是催化植物体内支链氨基酸(异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸)合成起始步骤的关键酶(herrera estrella l,blockm d,m essens e,et al.chimeric genes as dominant selectable markers in plantcells.the em bo journal,1983,2(6):987-995.)，是植物特有酶，动物体内没有该酶，因此可在对人畜无害的情况下，通过抑制als酶阻断支链氨基酸的生物合成达到清除杂草的目的。基于此，开发了als抑制剂类除草剂，如磺酰脲类、咪唑啉酮类、嘧啶水杨酸和磺酰胺类除草剂等。als的氨基酸序列发生改变可能会导致其蛋白结构发生改变，进而导致als抑制剂无法结合als，使得als对als抑制剂类除草剂的敏感性降低，从而对该除草剂产生抗性。开发新的能够赋予植物高抗性的als突变体对于除草剂抗性植物的选育和杂草防治具有重要意义。
技术实现思路
1、本专利技术提供植物als突变蛋白及其编码基因，并基于als突变蛋白及其编码基因提供一种以植物内源基因作为筛选标记的植物转基因筛选表达盒和筛选载体，并进一步提供抗als抑制剂类除草剂植物的制备方法。
2、具体地，本专利技术提供以下技术方案：p>
3、第一方面，本专利技术提供植物als突变蛋白，所述als突变蛋白与水稻野生型als蛋白相比，含有第101位氨基酸突变为脯氨酸的突变。
4、现有的als突变蛋白通常含有多个位点突变，通过多位点的组合突变才能够赋予植物较高的als抑制剂类除草剂抗性，单点突变的抗性水平通常较低。本专利技术发现，第101位氨基酸突变为脯氨酸的突变可显著提高als蛋白对于嘧啶水杨酸类除草剂的抗性，含有该突变的als突变蛋白能够赋予植物高嘧啶水杨酸类除草剂抗性。第101位氨基酸突变位点为本专利技术首次发现并取得了较好的als抑制剂类除草剂抗性效果。
5、优选地，所述als突变蛋白与水稻野生型als蛋白相比，含有第101位组氨酸突变为脯氨酸的突变。
6、优选地，所述als突变蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
7、本专利技术提供的上述als突变蛋白对于嘧啶水杨酸类除草剂(例如双草醚)具有较高的抗性。
8、第二方面，本专利技术提供编码以上所述的植物als突变蛋白的核酸分子。
9、以上所述的核酸分子包括dna或rna。
10、基于上述植物als突变蛋白的氨基酸序列以及密码子规则，本领域技术人员能够获得编码所述als突变蛋白的核酸分子的核苷酸序列，基于密码子的简并性，上述核酸分子的核苷酸序列并不唯一，但所有能够编码产生上述als突变蛋白的核酸分子均在本专利技术的保护范围内。
11、在本专利技术的一些实施方式中，所述核酸分子的核苷酸序列如seq id no.2所示。
12、第三方面，本专利技术提供包含所述核酸分子或表达所述植物als突变蛋白的生物材料。
13、优选地，所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
14、其中，所述宿主细胞不包含能够发育为植物完整植株的植物细胞。所述宿主细胞可为微生物细胞或动物细胞。
15、在本专利技术的一些实施方式中，所述表达盒由启动子和所述核酸分子可操作性地连接得到。
16、在本专利技术的一些实施方式中，所述表达盒由启动子、所述核酸分子和终止子可操作性地连接得到。
17、在本专利技术的一些实施方式中，所述载体为质粒载体，包括复制型载体和非复制型载体。
18、在本专利技术的一些实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌或农杆菌，但宿主细胞的种类并不局限于此，可以为任意的微生物细胞或可用于蛋白表达的动物细胞。
19、第四方面，本专利技术提供一种植物转基因筛选表达盒，所述表达盒包含以上所述的核酸分子以及用于启动和终止所述核酸分子转录的启动子和终止子。
20、在本专利技术的一些实施方式中，所述植物转基因筛选表达盒包含氨基酸序列如seqid no.1所示的植物als突变蛋白的编码基因。本专利技术发现，该als突变蛋白适于作为植物转基因筛选标记，在植物基因转化过程中能够高效地发挥筛选标记的功能，实现较高的筛选效率。
21、在本专利技术的一些实施方式中，所述植物转基因筛选表达盒包含序列如seq idno.2所示的als突变蛋白的编码基因。
22、上述表达盒中，启动子可为植物组成型启动子或植物组织特异性启动子，终止子为在植物中可以终止基因转录的dna序列。
23、优选地，所述启动子为水稻als基因启动子，水稻或玉米的ubi启动子、actin启动子、rubisco小亚基启动子或cab启动子。所述终止子为水稻als基因终止子或ubi终止子。
24、在本专利技术的一些实施方式中，所述启动子为水稻als基因启动子，所述终止子为水稻ubi终止子。本专利技术发现，采用水稻als基因启动子和ubi终止子配合调控上述als突变蛋白编码基因的转录，能够更好地控制该基因的高效、稳定、适度表达，使得als突变蛋白更好地发挥筛选标记的功能。
25、在本专利技术的一些实施方式中，所述植物转基因筛选表达盒的核苷酸序列如seq idno.3所示。
26、第五方面，本专利技术提供一种植物遗传转化筛选载体，所述载体包含以上所述的核酸分子或所述植物转基因筛选表达盒。
27、优选地，所述植物遗传转化筛选载体通过克隆其他表达盒进入该载体进行遗传转化，其中，其他表达盒是指除上述植物转基因筛选表达盒以外的表达盒，包括但不限于荧光蛋白表达盒、gus报告基因表达盒、抗虫表达盒、抗除草剂表达盒等。
28、在本专利技术的一些实施方式中，所述植物遗传转化筛选载体为植物双元表达载体。
29、在本专利技术的一些实施方式中，所述植物遗传转化筛选载体还包含一系列多克隆位点如avrii、acc65i、paci、pmei、ecor i、eco53k i、sac i等，以便后续克隆目的基因的连入。
30、在本专利技术的一些实施方式中，所述植物遗传转化筛选载体的核苷酸序列如seq idno.4所示。
31、以上所述的植物遗传转化筛选载体可通过以下方法制备得到：
32、(1)构建植物转基因筛选表达盒：将序列如seq id no.2所示的als突变蛋白编码基因置于水稻als基因启动子alspro驱动下表达，在其下游以水稻ubi终止子终止表达，得到序列如seq id no.3所示所示的植物转基因筛选表达盒；
33、(2)将步骤(1)得到的植物转基因筛选表达盒连入植物双元表达载体pc1300-alspro-mcs-osubit，获得植物遗传转化筛选载体。
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【技术保护点】
1.植物ALS突变蛋白，其特征在于，所述ALS突变蛋白与水稻野生型ALS蛋白相比，含有第101位氨基酸突变为脯氨酸的突变。
2.根据权利要求1所述的植物ALS突变蛋白，其特征在于，所述ALS突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1或2所述的植物ALS突变蛋白。
4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
5.生物材料，其特征在于，所述生物材料包含权利要求3或4所述的核酸分子或表达权利要求1或2所述的植物ALS突变蛋白。
6.一种植物转基因筛选表达盒，其特征在于，所述表达盒包含权利要求3或4所述的核酸分子以及用于启动和终止所述核酸分子转录的启动子和终止子。
7.根据权利要求6所述的表达盒，其特征在于，所述启动子为水稻ALS基因启动子，水稻或玉米的Ubi启动子、Actin启动子、Rubisco小亚基启动子或Cab启动子；
8.一种植物遗传转化筛选载体，其特征在于，所述载体包含权利要求
9.权利要求1或2所述的植物ALS突变蛋白或权利要求3或4所述的核酸分子或权利要求5所述的生物材料或权利要求6或7所述的植物转基因筛选表达盒或权利要求8所述的植物遗传转化筛选载体的以下任一种应用：
10.一种抗ALS抑制剂类除草剂植物的制备方法，其特征在于，所述方法包括：使植物含有权利要求3或4所述的核酸分子或表达权利要求1或2所述的植物ALS突变蛋白。
...【技术特征摘要】
1.植物als突变蛋白，其特征在于，所述als突变蛋白与水稻野生型als蛋白相比，含有第101位氨基酸突变为脯氨酸的突变。
2.根据权利要求1所述的植物als突变蛋白，其特征在于，所述als突变蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
3.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1或2所述的植物als突变蛋白。
4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如seq idno.2所示。
5.生物材料，其特征在于，所述生物材料包含权利要求3或4所述的核酸分子或表达权利要求1或2所述的植物als突变蛋白。
6.一种植物转基因筛选表达盒，其特征在于，所述表达盒包含权利要求3或4所述的核酸分子以及用于启动和终止所述核酸分...
【专利技术属性】
技术研发人员：欧阳超，赵惠敏，安保光，陈建南，陈思兰，
申请(专利权)人：海南波莲科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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