一种同时检测三类产毒真菌的多重数字PCR方法技术

本发明专利技术涉及一种基于多重微滴式数字PCR技术同时检测三类产毒真菌的方法及其在微生物发酵茶中的应用。所述三类产毒真菌包括产黄曲霉素真菌、产赭曲霉素真菌、产桔青霉素真菌。本发明专利技术方法直接靶向毒素合成基因设计引物探针，特异性强，并结合数字PCR技术高灵敏度、耐受性好的优势，建立同时检测三类产毒真菌的多重体系，实现高通量检测。本发明专利技术方法应用于微生物发酵茶，可对产毒真菌的存在提前预警，使发酵茶免受真菌毒素污染，保障微生物发酵茶质量安全。全。全。

【技术实现步骤摘要】
一种同时检测三类产毒真菌的多重数字PCR方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学检测领域，尤其涉及一种基于多重微滴数字PCR同时检测产黄曲霉素真菌、产赭曲霉素真菌和产桔青霉素真菌的方法及其在微生物发酵茶中的应用。

技术介绍

[0002]微生物发酵茶在微生物作用下形成的独特的茶叶品质风味，同时加工过程中得益于微生物的参与，形成独有的功能成分，具有其他茶类不具备的保健功效，成为受欢迎的健康饮料。由于微生物发酵茶中微生物区系复杂，生产及贮藏过程中产毒真菌及真菌毒素的防治一直是人们关注的问题。最新研究表明，微生物发酵茶中分离出的芽孢杆菌菌株对产赭曲霉素真菌生长具有抑制作用
[1]，并且微生物发酵茶中分离的多肽能有效抑制茶基质上赭曲霉毒素A(OTA)的产生
[2]。茶叶基质不利于产毒，且其中的有益微生物及成分可以控制有害微生物生长、抑制毒素合成，可见微生物发酵茶受到真菌毒素污染的机率极小。即使再小的潜在风险也要有必要提高防范意识，提前建立食品安全检测技术方法，才能“防患于未然”，保障微生物发酵茶的质量安全。
[0003]1993年，Tang首次将PCR技术应用于产毒真菌的检测鉴定
[3]，发展至今，产毒真菌的分子鉴定技术已经非常成熟，但仍存在许多不足：传统PCR灵敏度较低，无法检测污染前期微量的产毒真菌菌体；一种食品中可能包含多类产毒真菌，单重检测成本高且效率低。随着科学技术的进步，微滴式数字PCR作为一种新兴的分子检测手段，具有高灵敏度、绝对定量高通量、耐受性强等优势，迅速被应用于多种食品的病原菌检测。但该技术在微生物发酵茶中的应用目前未见报道。对于具有复杂基质的微生物发酵茶，其中高含量的多酚多糖是常见的PCR抑制剂，易干扰反应体系，导致检测结果不准确。因此，利用微滴式数字PCR技术的优势开发一种高效准确的检测方法对微生物发酵茶的质量安全监测具有重要意义。
[0004]本专利技术选择食品中三类常见的产毒真菌(产黄曲霉素真菌、产赭曲霉素真菌和产桔青霉素真菌)作为检测对象，根据真菌毒素合成基因设计特异性引物和探针，靶向检测产毒菌株，特异性强；结合微滴式数字PCR技术，建立同时检测三种常见产毒真菌的方法，灵敏度高，可精准检测污染早期的微量产毒真菌，在毒素产生前提前预警，三种产毒真菌在同一体系中的同时检测，省去了对单一产毒真菌的分别多次检测，降低成本、缩短检测时间，解决了许多传统PCR在产毒真菌检测中的痛点；将分子生物技术应用于微生物发酵茶中的质量安全检测，结合微滴式数字PCR耐受性强的优势，提高检测结果的准确性，克服微生物发酵茶检测中易受抑制物干扰的难点，保障微生物发酵茶质量安全。

技术实现思路

[0005]本专利技术的一个目的在于，提供一个同时检测产黄曲霉素真菌、产赭曲霉素真菌和产桔青霉素真菌三类产毒真菌的多重微滴数字PCR方法。
[0006]本专利技术的另一目的在于，提供同时检测产黄曲霉素真菌、产赭曲霉素真菌和产桔
青霉素真菌的多重微滴数字PCR方法在微生物发酵茶中的应用。
[0007]为实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0008]本专利技术首先建立基于以质粒为模板同时检测三种产毒真菌的多重数字PCR检测方法。在此基础上，利用所建立多重数字PCR方法检测微生物发酵茶。
[0009]本专利技术提供同时检测三类产毒真菌的多重数字PCR的特异性引物和探针，所述三类产毒真菌为产黄曲霉素真菌、产赭曲霉素真菌和产桔青霉素真菌，同时提供在同一体系中根据产黄曲霉素真菌、产赭曲霉素真菌和产桔青霉素真菌的产毒基因设计的特异性引物及探针。
[0010]其中，用以扩增产黄曲霉素真菌的产毒基因AflR的引物对及探针为：
[0011]AflR
‑
F：5'
‑
GCACCCTGTCTTCCCTAACA
‑
3'
[0012]AflR
‑
R：5'
‑
ACGACCATGCTCAGCAAGTA
‑
3'
[0013]AflR
‑
P：FAM
‑
CACGGGTGGGAGGTTGGGC
‑
BHQ1
[0014]其中，用以扩增产赭曲霉素真菌的产毒基因AoLC35
‑
12L的引物对及探针为：
[0015]AoLC35
‑
12L
‑
F：5'
‑
GCCAGACCATCGACACTGCATGCTC
‑
3'
[0016]AoLC35
‑
12L
‑
R：5'
‑
CGACTGGCGTTCCAGTACCATGAGCC
‑
3'
[0017]AoLC35
‑
12L
‑
P：HEX
‑
ACGAGTCTCTGGGAGACGTCAG
‑
BHQ1
[0018]其中，用以扩增产桔青霉素真菌的产毒基因ctnA的引物对及探针为：
[0019]ctnA
‑
F：5'
‑
TCGGTTGGACTCTACAGCAAGGAT
‑
3'
[0020]ctnA
‑
R：5'
‑
CGGTGGTGAAGTATCTGAACGGATG
‑
3'
[0021]ctnA
‑
P1：FAM
‑
TCGGTTGGACTCTACAGCAAGGATGGCCC
‑
BHQ1
[0022]ctnA
‑
P2：HEX
‑
CGGGCAACACGGGTGGGAGG
‑
BHQ1
[0023]本专利技术提供同时检测三种产毒真菌的多重数字PCR检测方法，具体步骤如下：
[0024](1)配置微滴式数字PCR的反应体系；
[0025](2)以步骤(1)中配置的体系生成微滴；
[0026](3)以步骤(2)中生成的微滴进行PCR扩增，扩增产黄曲霉素真菌、产赭曲霉素真菌和产桔青霉素真菌的产毒基因。
[0027](4)读取和分析步骤(3)中微滴式数字PCR反应扩增结果，得到产黄曲霉素真菌、产赭曲霉素真菌和产桔青霉素真菌产毒基因的拷贝浓度。
[0028]其特征在于，步骤1)所述体系DNA模板为包含产黄曲霉素真菌的产毒基因AflR片段、产赭曲霉素真菌的产毒基因AoLC35
‑
12L片段、产桔青霉素真菌的产毒基因ctnA片段的质粒DNA。
[0029]其特征在于，步骤1)所述体系的探针标记有不同的荧光基团。所述产黄曲霉素真菌探针用FAM荧光基团标记，产赭曲霉素真菌探针用HEX荧光基团标记，产桔青霉素真菌探针用两条探针检测，这两条探针分别用FAM和HEX两种荧光基团标记本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于多重微滴式数字PCR同时检测三类产毒真菌的方法，其特征在于同时检测产黄曲霉素真菌、产赭曲霉素真菌、产桔青霉素真菌三类产毒真菌。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述数字PCR方法为微滴数字PCR方法(Droplet Digital PCR)。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所用特异性引物探针是根据三种产毒真菌对应的产毒基因设计的，即黄曲霉毒素合成基因AflR、赭曲霉素合成基因AoLC35
‑
12L、桔青霉素合成基因ctnA，检测对象为三类产毒菌株。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，产黄曲霉素真菌、产赭曲霉素真菌和产桔青霉素真菌三类产毒真菌在同一体系中的同时检测。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，基于多重数字PCR技术在同一体系中同时检测产黄曲霉素真菌、产赭曲霉素真菌和产桔青霉素真菌，包括以下步骤：(1)配置微滴式数字PCR的反应体系；(2)以步骤(1)中配置的体系生成微滴；(3)以步骤(2)中生成的微滴进行PCR扩增，扩增产黄曲霉素真菌、产赭曲霉素真菌和产桔青霉素真菌的产毒基因；(4)读取和分析步骤(3)中微滴式数字PCR反应扩增结果，得到产黄曲霉素真菌、产赭曲霉素真菌和产桔青霉素真菌的产毒基因拷贝浓度。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所配置体系包括根据产黄曲霉素真菌、产赭曲霉素真菌和产桔青霉素真菌的产毒基因所设计的特异性引物及探针。其中，用以扩增产黄曲霉素真菌的产毒基因AflR的引物对及探针为：AflR
‑
F：5'
‑
GCACCCTGTCTTCCCTAACA
‑
3'AflR
‑
R：5'
‑
ACGACCATGCTCAGCAAGTA
‑
3'AflR
‑
P：FAM
‑
CACGGGTGGGAGGTTGGGC
‑
BHQ1其中，用以扩增产赭曲霉素真菌的产毒基因AoLC35
‑
12L的引物对及探针为：AoLC35
‑
12L
...

【专利技术属性】
技术研发人员：李勤，晏玲玲，王超，陈国和，王乐涯，黄建安，刘仲华，胡尹麒，郭磊，
申请(专利权)人：湖南寰辉医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：