谷子抗白发病KASP分子标记引物、谷子抗白发病检测试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种谷子抗白发病KASP分子标记引物、谷子抗白发病检测试剂盒及应用，属于分子生物学技术领域。本发明专利技术的谷子抗白发病KASP分子标记引物包括9对引物对，所述引物对的序列如：SEQ ID No.1～SEQ ID No.27所示。本发明专利技术利用群体表型和生物信息学方法从谷子基因组中挖掘抗白发病基因并筛选优异单倍型，开发KASP抗病分子标记，克服了谷子抗白发病分子标记获取困难的技术问题；本发明专利技术使用从RILs群体中获取抗病优异单倍型位点，并开发KASP分子标记在自然群体中进行验证，测定结果真实可靠；本发明专利技术获取谷子KASP抗病分子标记引物的方法简单，操作简便，获得的分子标记真实可靠，为谷子抗感品种鉴定及谷子抗病育种奠定基础。谷子抗感品种鉴定及谷子抗病育种奠定基础。谷子抗感品种鉴定及谷子抗病育种奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
谷子抗白发病KASP分子标记引物、谷子抗白发病检测试剂盒及应用


[0001]本专利技术属于分子生物学
，特别是涉及谷子抗白发病KASP分子标记引物、谷子抗白发病检测试剂盒及应用。

技术介绍

[0002]谷子（Setaria italica）在中国有8000多年的栽培历史，由于其籽粒中氨基酸和维生素的含量高于其它谷类作物，并且可以降低糖尿病及其它心血管疾病的风险，几千年来一直被作为主食作物在我国栽培。同时以其较高的产量和在不利的农业经济条件下生长的能力而闻名世界，逐渐成为世界上主要的杂粮作物之一，也被认为是全球气候急剧变化情况下最具发展潜力的作物之一。
[0003]由专性的生物营养卵菌
‑
禾生指梗霉菌引起的（Sclerospora graminicola，Sacc.）Schroeter霜霉病是一种危害谷子、珍珠粟等禾谷类作物的严重病害，在印度、中国、日本和非洲国家等地区均有发生，尤其是在干旱和半干旱地区，严重影响禾本科作物的产量和质量，是农业生产的一大不利因素。
[0004]目前，谷子白发病抗性机理的研究主要集中在生理生化方面，主要包括β
‑
1,3
‑
葡聚糖酶、富含羟脯氨酸的糖蛋白、超氧化物歧化酶和苯丙氨酸解氨酶等。转录组分析表明，接种S .graminicola后，抗病品种中R基因、PR蛋白、过敏性坏死反应相关基因和植物激素信号转导途径相关基因上调表达；而S .graminicola成功侵染谷子后，会导致谷子叶片黄化，叶绿素结构破坏，光系统相关基因表达下调，最终影响谷子的产量。珍珠粟抗霜霉病QTL位点的鉴定目前已有报道。通过构建抗、感品种杂交群体，已在连锁群LG1、LG2、LG4上检测到抗性QTL位点；Gulia等利用 RFLP和SSR标记对珍珠粟进行了抗霜霉病QTL定位，确定了9个可能的主效抗霜霉病QTL；Taunk等人的研究同样将抗霜霉病QTL位点定位于LG1或LG4上。珍珠粟是一种高度异花授粉的二倍体C4植物（2n=14），而作为S .graminicola另一种重要寄主的谷子是二倍体自花授粉作物，9对染色体（2n=18），谷子白发病抗性QTL位点是否与珍珠粟一致还需要进一步研究。
[0005]KASP技术是由英国LGC公司开发的新一代高通量自动化SNP检测技术，现已成为国际上SNP分型以及插入缺失变异检测的主要方法之一。其基本程序是：利用带有两种通用标签并连接SNP位点的两条正向引物和一条反向引物构成 Primer mix。带有不同荧光信号的两条检测引物Master mix，经三次PCR反应进行SNP位点荧光检测。同其他检测技术相比，KASP技术只需合成两个带有不同颜色的荧光基团和双链通用的探针，不需要针对每个SNP位点分别设计荧光探针，具有高通量、准确、省时、便捷、低成本的特点，实现了更加灵活的检测，已成功用于超过100多个物种的基因分型、遗传多样性分析、指纹图谱构建等方面。目前，尚未有针对谷子抗白发病的KASP分子标记的开发及应用的相关研究，因此，谷子抗白发病KASP分子标记的研究对谷子抗病材料的鉴定及谷子抗病育种具有重要的意义。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种谷子抗白发病KASP分子标记引物、谷子抗白发病检测试剂盒及应用，本专利技术使用从不同地域分离的谷子白发病菌菌株对开发的SSR引物进行PCR鉴定，所获扩展序列多态性高、测定结果真实可靠。
[0007]本专利技术的目的是提供谷子抗白发病KASP分子标记引物，包括9对引物对，所述引物对的序列如：SEQ ID No.1～3、SEQ ID No.4～6、SEQ ID No.7～9、SEQ ID No.10～12、SEQ ID No.13～15、SEQ ID No.16～18、SEQ ID No.19～21、SEQ ID No.22～24、SEQ ID No.25～27所示。
[0008]本专利技术的另一目的是提供一种谷子抗白发病KASP分子标记引物在对不同品种谷子抗白发病分析中的应用。
[0009]本专利技术提供的谷子抗白发病KASP分子标记引物在对不同品种谷子抗白发病分析中的应用，包括如下步骤：步骤一：提取不同品种谷子叶片材料的DNA；步骤二：用权利要求1所述SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.27所示的引物对步骤一提取的DNA进行竞争性等位基因特异性PCR（KASP）；步骤三：使用荧光定量PCR仪读取步骤二所得扩增产物的荧光信号值；步骤四：根据荧光信号值，对样品进行聚类分簇，进一步根据样品簇确定基因型，对谷子品种进行抗病性分析。
[0010]进一步地，竞争性等位基因特异性PCR扩增的体系为10μL：HiGeno 2
×ꢀ
Probe Mix 5μL，引物混合物0.14μL，ddH2O 3μL，10ng
·
μL
‑1DNA 1.86μL；其中，引物混合物由下述引物混合得到：100μM KASP
‑
F1引物12μL、100μM KASP
‑
F2引物12μL、100μM KASP
‑
R引物30μL、ddH2O 46μL。
[0011]进一步地，所述PCR扩增的程序为：95℃预变性10min；95℃变性20s，61
‑
55℃退火和延伸40s，10个循环，每个循环退火和延伸的温度依次降低0.6℃；95℃变性20s，55℃退火和延伸 40s，30次循环。PCR 扩增循环结束后，在终点荧光模式下，利用荧光定量 PCR 仪读取荧光信号值并保存。
[0012]本专利技术还提供了一种谷子抗白发病检测试剂盒，包括本专利技术所述的谷子抗白发病KASP分子标记引物。
[0013]本专利技术提供的谷子抗白发病检测试剂盒，还包括HiGeno 2
×ꢀ
Probe Mix和基因组提取试剂。
[0014]本专利技术提供所述的谷子抗白发病检测试剂盒在对不同品种谷子抗白发病分析中的应用。
[0015]本专利技术与现有技术相比，其有益效果为：
[0016]本专利技术利用群体表型和生物信息学方法从谷子基因组中挖掘抗白发病基因并筛选优异单倍型，开发KASP抗病分子标记，克服了谷子抗白发病分子标记获取困难的技术问题；本专利技术使用从RIL群体中获取抗病优异单倍型位点，并开发KASP分子标记在自然群体中进行验证，测定结果真实可靠；本专利技术获取谷子KASP抗病分子标记引物的方法简单，操作简便，获得的分子标记
真实可靠，为谷子抗感品种鉴定及谷子抗病育种奠定基础。
附图说明
[0017]图1为本专利技术中RIL群体变异检测Bin标记图；图2为本专利技术QTL定位遗传图谱；图3a为本专利技术候选基因Seita.8G193500在RILs群体中单倍型分析结果图；图3b为本专利技术候选基因Seita.8G193700在RILs群体中单倍型分析结果图；图3c为本专利技术候选基因Seita.8G194100在RILs群体中单倍型分析结果图；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.谷子抗白发病KASP分子标记引物，包括9对引物对，所述引物对的序列如：SEQ ID No.1～3、SEQ ID No.4～6、SEQ ID No.7～9、SEQ ID No.10～12、SEQ ID No.13～15、SEQ ID No.16～18、SEQ ID No.19～21、SEQ ID No.22～24、SEQ ID No.25～27所示。2.权利要求1所述的谷子抗白发病KASP分子标记引物在对不同品种谷子抗白发病分析中的应用。3.根据权利要求2所述的谷子抗白发病KASP分子标记引物在对不同品种谷子抗白发病分析中的应用，其特征在于，包括如下步骤：步骤一：提取不同品种谷子叶片材料的DNA；步骤二：用权利要求1所述SEQ ID No.1～SEQ ID No.27所示的引物对步骤一提取的DNA进行竞争性等位基因特异性PCR；步骤三：使用荧光定量PCR仪读取步骤二所得扩增产物的荧光信号值；步骤四：根据荧光信号值，对样品进行聚类分簇，进一步根据样品簇确定基因型，对谷子品种进行抗病性分析。4.根据权利要求3所述的谷子抗白发病KASP分子标记引物在对不同品种谷子抗白发病分析中的应用，其特征在于，竞争性等位基因特异性PCR扩增体系为10μL：HiGeno 2
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【专利技术属性】
技术研发人员：张宝俊，刘旭，孙玉荣，张诺，张天瀚，王金叶，王雪，韩渊怀，
申请(专利权)人：山西农业大学，
类型：发明
国别省市：