本发明专利技术公开了一种高效、灵敏的检测葡萄卷叶病的方法，属于植物病毒病检测技术领域。该方法通过测定葡萄叶片CHS1基因的表达量从而检测葡萄植株感染卷叶病毒的状况，具体的，用SEQ ID NO:1所示的上游引物和SEQ ID NO:2所示的下游引物检测葡萄叶片CHS1基因的表达量。本发明专利技术在深入探究染病植株在不同发病时期病毒载量变化，以及花青素合成途径相关基因表达量变化的基础上，发现了葡萄CHS1基因显著受病毒诱导表达，且在葡萄植株感染卷叶病毒早期，即肉眼可见的症状较轻微、病毒载量很低难以检测时，CHS1基因已有极显著的高表达，可以快速、灵敏的反映葡萄感染卷叶病毒的状况。灵敏的反映葡萄感染卷叶病毒的状况。灵敏的反映葡萄感染卷叶病毒的状况。
【技术实现步骤摘要】
一种高效、灵敏的检测葡萄卷叶病的方法
[0001]本专利技术涉及一种检测葡萄病毒病的方法，具体涉及一种高效、灵敏的检测葡萄卷叶病的方法，属于植物病毒病检测
技术介绍
[0002]近年来，全世界葡萄栽培地区受葡萄病毒病的危害有加重趋势，造成了严重的经济损失，已引起高度重视。其中，葡萄卷叶病(Grapevine leafroll disease，GLD)是葡萄上发生最为广泛、危害葡萄最为严重的病毒病之一，在全世界各葡萄主产区都造成了巨大的经济损失。葡萄卷叶病毒主要通过嫁接传染，并随繁殖材料(接穗、砧木、苗木)远距离传播扩散，造成了葡萄卷叶病毒危害范围扩大。另外，葡萄卷叶病毒还可以通过粉蚧和介壳虫等传播介体近距离传播。葡萄一旦感病则终生带毒，至今还没有特效药剂防治葡萄卷叶病毒。目前生产中所使用的药剂主要是增强树体的抗病性，延缓和减轻病毒症状。葡萄感病后，其嫁接成活率大大降低，会引起多方面负面影响，例如：树势衰弱、果实成熟延迟、果粒大小不均、果实着色不良、含糖量下降、产量降低、风味下降等，严重时还会导致树体死亡。
[0003]葡萄卷叶病具有半潜隐的特性，在大部分生长季节症状表现不明显，而在果树落叶前到果实采收症状表现最为明显。感病葡萄植株表现的典型症状因病毒株系、寄主品种、其它病毒的复合侵染和环境条件的不同而有所差异。例如，红色品种感染葡萄卷叶病毒后，在春末或夏季病株基部叶片脉间会出现红色斑点，症状表现时间取决于当地的气候和地理位置，随着时间的推移，斑点逐渐扩大，连接成片，秋季整个叶片变为暗红色，但叶脉仍然保持绿色，叶片增厚变脆，向下反卷，这些症状会从病株基部叶片向顶部叶片扩展，严重时整株叶片表现症状，树势非常衰弱。在白色品种上，症状表现相似，但是叶片颜色会变黄而不是红色，叶脉有轻微的褪绿症状。
[0004]当前防控葡萄病毒病的最主要措施是栽植脱毒苗，而快速、灵敏、高效的病毒检测技术是培育脱毒苗的关键一环。目前，检测葡萄病毒最常用的方法是逆转录
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聚合酶链式反应(reverse transcription
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PCR，RT
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PCR)，这种方法克服了指示植物检测法准确度不高的缺陷，同时也克服了血清学检测病毒需要有外壳蛋白的限制，这些使得RT
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PCR检测方法成为主要的检测葡萄病毒病的主要方法，但RT
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PCR检测方法仍然存在一些问题，例如：
[0005](1)用于检测葡萄卷叶病毒的引物根据病毒的基因组序列来设计合成，但在实际应用中，病毒存在多种亚型和自然突变，如果用于检测的序列保守性差，则检测精度就会大大降低，且病毒含量在植株体内分布不均，这种状况极易造成假阴性反应；
[0006](2)运用传统的方法提取病毒RNA的步骤繁琐复杂、耗时长、毒性较大，同时对操作人员技术要求高，检测难度和成本较高，且难以大范围、高通量检测；
[0007](3)植物中的病毒载量通常在发病早期较低，在没有明显发病症状的前提下检测难度较大、精准度不足，在病毒病的提前检测和预防中存在较大的局限性。
[0008]由于发病症状复杂，所以葡萄卷叶病难以凭借田间症状准确判断，目前已有的检测手段包括病毒ELISA检测、病毒核酸检测等，这些手段要求提取高质量蛋白或核酸，否则
难以精准检测、痕量检测。此外，由于病毒在植物体内分布不均，可能因取材不足而导致误检、漏检，对取材覆盖的范围和数量提出了更高的要求。以上因素导致现有的检测手段存在工序复杂、费用高以及对技术人员操作水平要求高等弊端。因此，专利技术一种灵敏、高效、便利的葡萄卷叶病检测方法，在一定程度上可以预防葡萄卷叶病毒的扩散，对于葡萄生产和育苗产业具有重大意义。
技术实现思路
[0009]为解决现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种通过葡萄自身基因在感染卷叶病毒前后表达水平的变化，间接判断葡萄植株是否感染卷叶病毒的方法，该方法克服了在病毒载量低、病毒分布不均匀等情况下难以检测出葡萄卷叶病病毒的难题，是一种高效、灵敏的检测葡萄卷叶病的方法。
[0010]为了实现上述目标，本专利技术采用如下的技术方案：
[0011]一种高效、灵敏的检测葡萄卷叶病的方法，通过测定葡萄叶片CHS1基因的表达量从而检测葡萄植株感染卷叶病毒的状况，具体的，用SEQ ID NO:1所示的上游引物和SEQ ID NO:2所示的下游引物检测葡萄叶片CHS1基因的表达量。
[0012]优选的，检测葡萄叶片CHS1基因的表达量的方法包括以下步骤：
[0013]Step1：取待测葡萄叶片组织，提取植物和病毒总RNA；
[0014]Step2：抑制植物和病毒总RNA降解，去除基因组DNA污染，反转录合成cDNA；
[0015]Step3：采用SEQ ID NO:1所示的上游引物和SEQ ID NO:2所示的下游引物对cDNA进行荧光定量PCR，检测CHS1基因的表达量，通过分析CHS1基因的表达量即可检测出葡萄植株感染卷叶病毒的情况。
[0016]优选的，在Step1中，提取植物和病毒总RNA的方法具体如下：
[0017](1)称取0.1
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0.2g葡萄叶片组织，放入研钵中，加入液氮将葡萄叶片组织研磨成粉末，将粉末转移到离心管中；
[0018](2)向离心管中加入500μl RCL裂解液，漩涡震荡混匀，55℃水浴3min充分分解核蛋白体；
[0019](3)在室温条件下，于12000rpm离心5min，取上清液小心转入新的基因组DNA过滤柱中，10000rpm离心2min，收集下滤液；
[0020](4)向收集管中加入等体积RCB缓冲液，颠倒混匀，将得到的溶液转入RNA吸附柱中，放在离心管中，14000rpm离心1min，弃滤液；
[0021](5)向RNA吸附柱中加入400μl RWF洗脱液II，10000rpm离心30s，弃滤液；
[0022](6)向RNA吸附柱中加入500μl RNA洗脱液II，10000rpm离心30s，弃滤液；
[0023](7)向RNA吸附柱中再次加入500μl RWF洗脱液II，10000rpm离心30s，弃滤液；
[0024](8)将RNA吸附柱10000rpm离心2min，充分干燥RNA吸附柱；
[0025](9)将RNA吸附柱转移到干净的离心管中，加入30μl去离子双蒸水，静置2min，10000rpm离心1min，收集产物，即得到植物和病毒总RNA。
[0026]优选的，在Step2中，抑制植物和病毒总RNA降解的体系为：
[0027][0028]抑制植物和病毒总RNA降解的反应为：65℃加热5min。
[0029]优选的，在Step2中，去除基因组DNA的体系为：
[0030][0031]去除基因组DNA的反应为：42℃加热2min。
[0032]优选的，在Step2中，反转录的体系为：
[0033本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种高效、灵敏的检测葡萄卷叶病的方法，其特征在于，通过测定葡萄叶片CHS1基因的表达量从而检测葡萄植株感染卷叶病毒的状况。2.根据权利要求1所述的高效、灵敏的检测葡萄卷叶病的方法，其特征在于，用SEQ ID NO:1所示的上游引物和SEQ ID NO:2所示的下游引物检测葡萄叶片CHS1基因的表达量。3.根据权利要求2所述的高效、灵敏的检测葡萄卷叶病的方法，其特征在于，检测葡萄叶片CHS1基因的表达量的方法包括以下步骤：Step1：取待测葡萄叶片组织，提取植物和病毒总RNA；Step2：抑制植物和病毒总RNA降解，去除基因组DNA污染，反转录合成cDNA；Step3：采用SEQ ID NO:1所示的上游引物和SEQ ID NO:2所示的下游引物对cDNA进行荧光定量PCR，检测CHS1基因的表达量，通过分析CHS1基因的表达量即可检测出葡萄植株感染卷叶病毒的情况。4.根据权利要求3所述的高效、灵敏的检测葡萄卷叶病的方法，其特征在于，在Step1中，提取植物和病毒总RNA的方法具体如下：(1)称取0.1
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0.2g葡萄叶片组织，放入研钵中，加入液氮将葡萄叶片组织研磨成粉末，将粉末转移到离心管中；(2)向离心管中加入500μl RCL裂解液，漩涡震荡混匀，55℃水浴3min充分分解核蛋白体；(3)在室温条件下，于12000rpm离心5min，取上清液小心转入新的基因组DNA过滤柱中，10000rpm离心2min，收集下滤液；(4)向收集管中加入等体积RCB缓冲液，颠倒混匀，将得到的...
【专利技术属性】
技术研发人员：张凯，王亚梅，程杰山，张洪霞，高晴，
申请(专利权)人：招远市盛慧农业技术发展有限公司，
类型：发明
国别省市：
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