本发明专利技术公开了一种从森林草莓愈伤组织中提取原生质体的方法，属于生物技术领域。该方法包括以下步骤：将森林草莓组培苗叶片诱导产生愈伤组织，分化培养，挑选浅绿色、质地松软、具颗粒感并且生长旺盛的丛生芽，破碎，过滤，23℃、60rpm酶解3h，离心收集绿色的沉淀，75μm和10μm尼龙网过滤，离心，重悬沉淀，即得到草莓愈伤组织原生质体悬浮液。本发明专利技术的有益之处在于：成功的提取出了二倍体草莓愈伤组织原生质体，克服了草莓叶片原生质体提取困难的问题，并且通过优化酶解液的配方，将酶解时间由14h以上缩短为3h，大大提高了提取效率；提取出来的草莓愈伤组织原生质体状态良好(形体饱满、活性高)，并且数量多、纯度高。纯度高。纯度高。
【技术实现步骤摘要】
一种从森林草莓愈伤组织中提取原生质体的方法
[0001]本专利技术涉及一种提取原生质体的方法，具体涉及一种从森林草莓愈伤组织中提取原生质体的方法，属于生物
技术介绍
[0002]原生质体培养和植株再生技术具有使用范围广和可行性强等优点，是植物生物工程的基础。由于原生质体具有结构简单、发育同步性好、群体数量大、DNA分子易于进入细胞、易获得纯合性转化子等特点，其培养技术与有关的细胞、分子和遗传等学科的交叉渗透，使植物原生质体的研究越来越受到重视。草莓为蔷薇科(Rosaceae)草莓属(Fragaria)草本植物，园艺学上属于多年生果树，作为重要的浆果类经济作物，经济价值高，生长周期短，具有营养丰富、果实芳香气味浓郁等优良性状。世界上草莓生产量最高、栽植面积最广的国家是中国，而森林草莓基因组(约240Mb)相对较小、植株短小、生命周期短、能够进行高效的遗传转化。本专利技术利用二倍体森林草莓“Ruegen”作为材料，优化从其愈伤组织中提取原生质体的方法，为后续运用分子生物学手段进行遗传转化，或培育出更多具有优良性状的栽培品种有重大的研究意义与应用价值。
[0003]原生质体融合是基因工程的必须手段之一，植物原生质体再生培养及悬浮培养等技术手段在各个植物中的应用潜力巨大。相较于其他模式植物与作物而言，草莓在细胞瞬时转化、细胞融合及果实品质、香气物质形成等分子机制解析方面的研究还不够深入，技术体系还不够完善。从森林草莓叶片中提取原生质体非常困难，究其原因是：二倍体草莓叶片单薄，为了适应环境形成了发达的栅栏组织和保卫细胞，叶肉细胞数量较少。森林草莓愈伤组织原生质体提取方法的建立，对于进一步开展原生质体融合、利用基因功能手段解析草莓重要生命活动机制研究等具有重要意义。同时，随着基因工程技术的发展，森林草莓原生质体在CRISPR/Cas9技术应用中也将得到进一步的开发和发展。
技术实现思路
[0004]为解决草莓叶片原生质体提取困难的问题，本专利技术的目的在于提供一种从森林草莓愈伤组织中高效率提取状态良好且数量充足的原生质体的方法。
[0005]为了实现上述目标，本专利技术采用如下的技术方案：
[0006]一种从森林草莓愈伤组织中提取原生质体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0007](1)取森林草莓组培苗叶片，通过离体造伤的方式在诱导培养基上诱导产生愈伤组织；
[0008](2)将步骤(1)所得愈伤组织进行切割，放入分化培养基上进一步培养；
[0009](3)从步骤(2)所得愈伤组织中挑选浅绿色、质地松软、具颗粒感并且生长旺盛的丛生芽，置于含冷蒸馏水的离心管中破碎，得到质地均一、细胞松散分离的愈伤组织碎片；
[0010](4)将步骤(3)所得愈伤组织碎片用45μm尼龙网过滤，将过滤后的愈伤组织放入混合酶解液中，23℃、60rpm酶解3h，得到溶液；
[0011](5)向步骤(4)所得溶液中加入等体积提取缓冲液终止酶解反应，用45μm尼龙网过滤，收集原生质体滤液，将滤液800rpm离心5min，弃上清液，绿色的沉淀即为原生质体；
[0012](6)将步骤(5)所得原生质体用75μm尼龙网过滤，将滤液用10μm尼龙网过滤，将尼龙网倒扣在离心管中，用提取缓冲液将原生质体冲洗下来；
[0013](7)将步骤(6)所得原生质体800rpm离心5min，弃上清液，用重悬液将沉淀重悬，即得到草莓愈伤组织原生质体悬浮液。
[0014]优选的，在步骤(1)中，所述诱导培养基由MS培养基、蔗糖、琼脂、吲哚丁酸和噻苯隆配制而成，蔗糖、琼脂、吲哚丁酸和噻苯隆的浓度分别为30g/L、9g/L、0.2mg/L、2.0mg/L。
[0015]优选的，在步骤(2)中，所述分化培养基由MS培养基、蔗糖、琼脂、吲哚丁酸和噻苯隆配制而成，蔗糖、琼脂、吲哚丁酸和噻苯隆的浓度分别为30g/L、9g/L、0.3mg/L、1.0mg/L。
[0016]优选的，在步骤(3)中，选取5～8g丛生芽，将选好的丛生芽置于含5mL冷蒸馏水的30mL离心管中破碎。
[0017]优选的，在步骤(4)中，所述混合酶解液由混合溶剂、多种酶以及牛血清白蛋白配制而成，其中：
[0018]混合溶剂由水、D
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甘露醇、2
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(N
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吗啡啉)乙磺酸、氯化钙和氯化钾配制而成，D
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甘露醇、2
‑
(N
‑
吗啡啉)乙磺酸、氯化钙和氯化钾的浓度分别为0.4mol/L、20mmol/L、10mmol/L、20mmol/L；
[0019]酶包括纤维素酶R
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10、离析酶R
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10和果胶酶Y
‑
23，浓度分别为10g/L、10g/L、1g/L；
[0020]牛血清白蛋白的浓度为1g/L；
[0021]用KOH调节pH值至5.7。
[0022]优选的，在步骤(5)和(6)中，所述提取缓冲液由水、2
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(N
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吗啡啉)乙磺酸、氯化钠、氯化钙、氯化钾和葡萄糖配制而成，2
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(N
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吗啡啉)乙磺酸、氯化钠、氯化钙、氯化钾和葡萄糖的浓度分别为4mmol/L、150mmol/L、0.5mmol/L、5mmol/L和5mmol/L。
[0023]优选的，在步骤(7)中，所述重悬液由水、2
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(N
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吗啡啉)乙磺酸、D
‑
甘露醇和氯化镁配制而成，2
‑
(N
‑
吗啡啉)乙磺酸、D
‑
甘露醇和氯化镁的浓度分别为2mmol/L、0.4mol/L、15mmol/L。
[0024]本专利技术的有益之处在于：
[0025](1)成功的提取出了二倍体草莓愈伤组织原生质体，克服了草莓叶片原生质体提取困难的问题，并且通过优化酶解液的配方，将酶解时间由14h以上缩短为3h，大大提高了提取效率；
[0026](2)提取出来的草莓愈伤组织原生质体状态良好(形体饱满、活性高)，并且数量多、纯度高。
附图说明
[0027]图1是草莓愈伤组织的酶解过程图，其中，CK是未酶解组织在显微镜下的细胞形态图，Bar＝10μm；
[0028]图2是从不同的草莓组织材料中提取的原生质体的形态图，其中，A是从草莓成熟叶片中提取的原生质体的形态图，B是从草莓再生丛生芽中提取的原生质体的形态图，C是从草莓愈伤组织中提取的原生质体的形态图，Bar＝2μm；
[0029]图3是通过本专利技术的方法提取得到的草莓愈伤组织原生质体的FDA染色观察结果图，Bar＝10μm；
[0030]图4是纯化前后草莓愈伤组织原生质体的形态图，其中，A是纯化前的草莓愈伤组织原生质体的形态图，B是纯化后的草莓愈伤组织原生质体的形态图。
具体实施方式
[0031本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种从森林草莓愈伤组织中提取原生质体的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取森林草莓组培苗叶片，通过离体造伤的方式在诱导培养基上诱导产生愈伤组织；(2)将步骤(1)所得愈伤组织进行切割，放入分化培养基上进一步培养；(3)从步骤(2)所得愈伤组织中挑选浅绿色、质地松软、具颗粒感并且生长旺盛的丛生芽，置于含冷蒸馏水的离心管中破碎，得到质地均一、细胞松散分离的愈伤组织碎片；(4)将步骤(3)所得愈伤组织碎片用45μm尼龙网过滤，将过滤后的愈伤组织放入混合酶解液中，23℃、60rpm酶解3h，得到溶液；(5)向步骤(4)所得溶液中加入等体积提取缓冲液终止酶解反应，用45μm尼龙网过滤，收集原生质体滤液，将滤液800rpm离心5min，弃上清液，绿色的沉淀即为原生质体；(6)将步骤(5)所得原生质体用75μm尼龙网过滤，将滤液用10μm尼龙网过滤，将尼龙网倒扣在离心管中，用提取缓冲液将原生质体冲洗下来；(7)将步骤(6)所得原生质体800rpm离心5min，弃上清液，用重悬液将沉淀重悬，即得到草莓愈伤组织原生质体悬浮液。2.根据权利要求1所述的从森林草莓愈伤组织中提取原生质体的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述诱导培养基由MS培养基、蔗糖、琼脂、吲哚丁酸和噻苯隆配制而成，蔗糖、琼脂、吲哚丁酸和噻苯隆的浓度分别为30g/L、9g/L、0.2mg/L、2.0mg/L。3.根据权利要求1所述的从森林草莓愈伤组织中提取原生质体的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述分化培养基由MS培养基、蔗糖、琼脂、吲哚丁酸和噻苯隆配制而成，蔗糖、琼脂、吲哚丁酸和噻苯隆的浓度分别为30g/L、9g/L、0.3mg/L、1.0mg/L。4.根据权利要求1所述的从森林草莓愈伤组织中提取原生质体的方法，其特征在于，在步骤(3)中，选取5～8g丛生芽，将选好的丛生芽置于含5mL冷蒸馏水的30mL离心管中破碎。5.根据权利要求1所述的从森林草莓愈伤...
【专利技术属性】
技术研发人员：张凯，王亚梅，张洪霞，刘炳福，于慧玲，
申请(专利权)人：招远市盛慧农业技术发展有限公司，
类型：发明
国别省市：
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