三角草外泌体提取方法及用途技术

本发明专利技术公开了一种三角草外泌体提取方法及用途，利用密度梯度离心法提取三角草外泌体活性成分，因外泌体不具备细胞核结构，在宿主体内不能扩增，临床应用具有较高的安全性，可以用于治疗创面修复及制成治疗创面修复的药物，而且，由于外泌体自身具有穿梭特性，并富含miRNA成分，可从植物体“跨界”调控其他生物体，未来有可能能够替代皮肤移植用于创伤愈合，应用前景极其广阔。用前景极其广阔。用前景极其广阔。

【技术实现步骤摘要】
三角草外泌体提取方法及用途


[0001]本专利技术涉及一种植物提取方法及用途，特别是一种三角草的提取方法及用途。

技术介绍

[0002]三角草为百合科植物，具有清热解毒、消炎止痛的功效，广东地区民间常用于治疗毒蛇咬伤、跌打肿痛（参考文献：梅全喜，钟希文，张晓君，等．三角草镇痛、抗炎作用研究［J］中药材，2000，23（10）：632．梅全喜，钟希文，昊惠妃，等. 跌打镇痛液时家兔耳微环的影响［J］中药材，2002，25（7）：493）。以三角草为主药研发的复方三角草片在消肿、镇痛、解蛇虫毒作用方面取得确切研究证据（参考文献：梅全喜，钟希文，林慧，等. 复方三角草片抗蛇毒作用的实验研究. 中国药业. 2005，14（1）：24
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25）和临床疗效（参考文献：繆英年，梅全喜，陈茂潮，等. 复方三角草制剂治疗蛇毒咬伤疗效观察. 中国中医急症，2005，14（5）：429
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431）。中山市中医院团队从复方三角草制剂配合西医常规处理治疗80例血循毒蛇咬伤患者的临床研究数据获悉，该药对各种血循蛇毒咬伤确有良好疗效。值得一提的是，毒蛇咬伤后伤口周围易引起广泛性组织坏死，形成难治性溃疡，创面难以愈合。而使用复方三角草制剂治疗者未发生伤口溃疡现象（参考文献：繆英年，梅全喜，陈茂潮，等. 复方三角草制剂治疗蛇毒咬伤疗效观察. 中国中医急症，2005，14（5）：429
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431）。并且，在广东中山地区民间也确有将三角草鲜品捣烂外敷的记载（参考文献：广东中药志编辑委员会.广东中药杂志（第2卷）［M］广州：广东科学技术出版社，1996，10
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11）。这启发了本专利技术人团队研发三角草的外用制剂，用于受损皮肤创面修复将有很大推广空间。
[0003]近年来，学界逐渐重视药用植物外泌体的研究。因外泌体不具备细胞核结构，在宿主体内不能扩增，临床应用具有较高的安全性，未来可以替代皮肤移植用于创伤愈合，应用前景极其广阔。皮肤中的细胞采用多种机制相互交流，其中之一就是外泌体。作为细胞分泌的关键一环，外泌体可以通过大部分毛细血管到达远处损伤部位。
[0004]外泌体是一类直径40
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100nm的微小囊泡，可以将脂类、碳水化合物、蛋白质、mRNA、miRNA和DNA等生物分子从一个细胞传递到另一个细胞，从而交换遗传信息、重编程宿主细胞，进行细胞间通讯。Regente（参考文献：Regente M，Corti
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Monz
ó
n G，Maldonado AM，et al. Vesicular fractions of sunflower apoplastic fluids are associated with potential exosome marker proteins. FEBS Lett，2009，583：3363
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3366）于2009年首次发现植物中存在外泌体样小泡。植物细胞外泌体的生物特征与动物外泌体相当，内含DNA、特异蛋白质和复杂RNA等，可以在细胞间转移传递核酸、生物活性脂质和蛋白质等物质。植物外泌体所含miRNA同样能够在人体血液中检测到并稳定存在，并起到特定的药理作用。
[0005]近年来陆续有研究认为miRNA可以跨物种调控基因表达，miRNA的跨物种调控已经有多篇文章报道，其中第一篇文章报道，2012年来自南京大学张辰宇实验室在Cell Research杂志发表的研究论文（参考文献：Lin Zhang，Dongxia Hou，Xi Chen，et al. Exogenous plant MIR168a specifically targets mammalian LDLRAP1：evidence of cross
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kingdom regulation by microRNA. Cell Research，2012，Jan；22（1）：107
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26），证
实植物miRNA可以不被动物所消化直接进入体内，并且还能调控哺乳动物靶基因的表达。丰富的miRNA不仅在原始系统内执行生物学功能，还可在植物和相互作用的生物体之间移动，实现“跨界基因”表达调控（参考文献：Huang F，Du J，Liang Z，et al. Large
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scale analysis of smallRNAs derived from traditional chinese herbs in human tissues，Sci China Life Sci，2019，62（3）：321
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332），发挥重要作用（参考文献：De Oca，A.M.；Madue
ñ
o，J.A.；Martinez
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Moreno，J.M. et al. High
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phosphate
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induced calcification is related to SM22α promoter methylation in vascular smooth muscle cells，J.Bone Miner.Res，2010，25，1996
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2005）。因此，来自药用植物外泌体的miRNA可能作为新的生物活性成分与生物动物系统相互作用。
[0006]药用植物外泌体“跨界”调控的生物活性相继积累大量基础研究数据（参考文献：Alexander Tsouknidas. Plant
‑
Derived extracelluar vesicles as therapeutic nanocarriers，International Journal of Melecular Sciences，2022，23，191）。生姜外泌体可调节肠道菌群（参考文献：Teng Y，Ren Y，Sayed M，et al. Plant
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derived exosomal micrornas shape the gut microbiota，Cell Host Microbe，2018，24（5）：637
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652），抑制结肠炎症（参考文献：Zhang M，Viennois E，Prasad M，et al. Edible ginger
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derived nanoparticles：A novel therapeutic approach for the prevention and treatment of inflammatory bowel disease and colitis
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associated cancer，Biomaterials，2016，101：321
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340），金银花的抗炎、抗病毒作用通过水煎液外泌体中所含miRNA2911起作用（参考文献：Zhou Z，Li X，Liu J，et a本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种三角草外泌体提取方法，其特征在于其步骤如下：（1）将1.5 kg去除根系的三角草全草洗净，用料理机进行破碎处理，得到样品A；（2）将样品A移至离心管内，1000
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g离心10min；（3）调整转速，3000
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g离心20min；（4）将温度设定为4 ℃，10000
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g离心30min，取上清，得到样品B；（5）将样品B在37 ℃水浴1
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2小时，得到样品C；（6）将样品C冷却至4 ℃，2000
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g离心30min，取上清，得到样品D；（7）将样品D转移至新的离心管中，4 ℃，10000
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g离心45 min，取上清，得到样品E；（8）将样品E转移至新的离心管中，4 ℃，100000
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g离心120 min，取上清，得到样品F；（9）将样品F 转移至新的离心管中，加入20 mL预冷的1
×
PBS重悬，然后保持4 ℃，2000
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g离心30 min，取上清，得到样品G；（10）将样品G 转移至新的离心管中，4 ℃，2000
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g离心30 min，取上清，得到样品H；（11）将样品H 转移至新的离心管中，4 ℃，2000
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g离心30 min，取上清，得到样品I；（12）将样品I转移至新的离心管中，4 ℃，100000
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g离心120 min，去除上清，得到样品J；（13）往样品J中加入...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘琳娜，王蕾，程鹏，李燕林，王宏，徐娟，陈冠，黄清秀，李昕，安海文，袁玲，杨文钦，江茜，康利，李锦山，林芬娜，甘沛敏，阮绍伟，潘钰榕，
申请(专利权)人：天津市医药科学研究所天津市医药与健康研究中心，
类型：发明
国别省市：