一种烟草原生质体制备方法技术

本申请属于烟草组织器官解剖技术领域，具体涉及一种烟草原生质体制备方法。该方法针对烟草根部细胞、或者烟叶细胞的原生质体制备分离应用，包括：准备酶解液、材料预处理、酶解提取、原生质体分离等步骤。在对现有植物细胞原生质体提取方法研究总结基础上，发明专利技术人结合烟草根组织、烟叶细胞的结构特点，结合次生代谢产生代谢组学研究需要，对酶解法制备原生质体过程中所需的生物酶类型和用量进行了进一步优化设计，构建了适合烟草根尖来源或者烟叶腺毛来源的原生质体制备方法。初步实验结果表明，制备所得原生质体数量多、活性高，同时由于相关提取方法简单快速、耗时较短，因此使得本申请具有较好的科研实用价值。申请具有较好的科研实用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种烟草原生质体制备方法


[0001]本申请属于烟草组织器官解剖
，具体涉及一种烟草原生质体制备方法。

技术介绍

[0002]烟草作为一种较为特殊的经济作物，不仅与国民经济发展高度相关，同时，因其生长周期相对较短，栽培管理相对简单，因此，烟草本身也是一种植物学研究中常用的模式植物。
[0003]植物学研究中，针对各类代谢产物或者细胞层面进行研究时，原生质体制备与获得是相关试验开展基础。植物原生质体是指除去细胞壁后而仅为原生质膜所包围的裸露细胞。
[0004]现有技术中，常用的原生质体制备与分离方法有机械法、化学法和酶解法等方法，其中酶解法因其安全性、有效性、相对可控性、快速性等优点，是目前较为主流的植物原生质体制备方法。但客观而言，由于不同植物细胞结构组成差异较大，加上研究目的不同，因此，植物原生质体的制备并无通用的制备方法，只能依据不同植物、以及不同植物组织器官及不同细胞区别，分别探索最适的原生质体分离制备方法。

技术实现思路

[0005]本申请目的在于提供一种适用于烟草次生代谢产物研究用的原生质体制备分离方法，从而为烟草细胞代谢组学研究奠定一定技术基础。
[0006]本申请所采取的技术方案详述如下。
[0007]一种烟草原生质体制备方法，该方法适用于烟草代谢组学研究中针对根部细胞、或者烟叶（腺毛）细胞的原生质体制备分离应用，具体包括如下步骤：（一）准备酶解液以烟草根尖、或烟叶（腺毛）为原生质体制备材料（原料）来源；针对烟草根尖材料时，原生质体制备用酶解液为：含有纤维素酶cellulast、果胶酶pectolyase（或离析酶Macerozyme）的MES缓冲液；具体配方组成为：MES、5mM+CaC12、10mM+NaCl、10mM+甘露醇Manmitol(pH=5.7)、0.35M+1.5%纤维素酶cellulast+1.0~1.5%果胶酶pectolyase（或离析酶Macerozyme）+0.1%BSA；针对烟叶（腺毛）材料时，原生质体制备用酶解液为：含有纤维素酶cellulast和离析酶Macerozyme的CPW缓冲液；具体配方组成为：缓冲液CPW（pH5.8）+甘露醇Manmitol(pH5.7)、0.4M+1%纤维素酶cellulast+0.5%离析酶Macerozyme；所述缓冲液CPW（pH5.8）：KH2PO4、27.2mg/L+KNO3、101.0mg/L+CaCl2•
2H2O、1480.0mg/L+MgSO4•
7H2O、246.0mg/L+KI、0.16mg/L+CuSO4•
5H2O、0.025mg/L；所述纤维素酶cellulast，例如为酶活10000U/g的cellulaseOnozukaR
‑
10；
所述果胶酶pectolyase，例如为酶活1000U/g的pectolyase Y
‑
23；所述离析酶macerozyme，例如为酶活3000U/g的macerozyme R
‑
10；（2）材料预处理以无菌培养的烟草、或新鲜烟叶（腺毛）为原生质体制备材料（原料）来源；预处理时：针对根组织，取烟草发芽生长7
‑
10天左右的根尖组织，无菌水清洗（不少于3次）后，滤纸吸干水分，沿根尖生长方向刀片切取0.5cm；针对烟叶组织，选取烟草发芽生长后4~6叶期完全伸展开的烟草叶片，置于冰上，快速切割成1mm左右宽度的细丝备用；所述烟草，具体例如K326、本氏烟或黄花烟；（3）酶解提取将步骤（2）中预处理后的根尖或者烟叶细丝，置于容器中，加入步骤（1）中所配制的对应酶解液，26℃~30℃，震荡处理1~5h（例如为：80rpm震荡处理3h）；具体用量方面：每100条根尖，酶解液用量为5mL；每片鲜烟叶，酶解液用量为10mL；（4）原生质体分离待步骤（3）中震荡处理结束后，将混合液过250目细胞筛以进行过滤；针对根尖的滤液，离心，保留沉淀，将沉淀用MES缓冲液（不含裂解酶）重悬后，即为烟草根尖原生质体提取液；针对烟叶的滤液，500rpm离心5~10min，保留上清，即为含有较高活性和纯度的烟草腺毛细胞原生质体提取液。
[0008]在对现有植物细胞原生质体提取方法研究总结基础上，专利技术人结合烟草根组织、烟叶细胞的结构特点，结合次生代谢产生代谢组学研究需要（根是烟草生物碱的合成部位，烟草腺毛是萜类、尤其是二萜的主要合成部位），对酶解法制备原生质体过程中所需的生物酶类型和用量进行了进一步优化设计，构建了适合烟草根尖来源或者烟叶腺毛来源的原生质体制备方法。
[0009]经过相关提取工艺参数优化后，初步实验结果表明，制备所得原生质体数量多、活性高，其中烟草根提取液中原生质体的数量可达1.0
×
106个/ml，烟草腺毛细胞叶片提取液中原生质体的数量可达5.3
×
105个/ml，而且所制备原生质体的活性均较高（>85%）。同时由于相关提取方法简单快速、耗时较短，因此使得本申请具有较好的科研实用价值，可为相关细胞学研究、代谢组学研究奠定良好的技术基础。
附图说明
[0010]图1为K326不同酶组合得到的根尖原生质体；图2为K326 的不同酶浓度得到的根尖原生质体；图3为K326不同处理时间下处理获得的根尖原生质体；图4为K326不同生长时间的根尖处理后获得的根尖原生质体；图5 为不同烟草品种根原生质体的活性检测结果；图中：A：本氏烟；B：K326；彩色视图下，亮黄色：活细胞；蓝色（蓝绿色）：死细胞或者细胞碎片；
图6为K326不同时间处理得到的烟叶（腺毛）原生质体；图7为 K326处理3小时后上清和沉淀中的烟叶（腺毛）原生质体细胞；图8为K326不同甘露醇处理条件下的烟叶（腺毛）原生质体；图9为K326和黄花烟叶片裂解后获得的烟叶（腺毛）原生质体。
具体实施方式
[0011]下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。
[0012]实验材料：纤维素酶cellulast：cellulase Onozuka R
‑
10（酶活10000U/g）、离析酶macerozyme: macerozyme R
‑
10（酶活3000U/g）、果胶酶 pectolyase：pectolyase Y
‑
23（酶活1000U/g），均为Yakult Japan公司产品；烟草材料：栽培烟草K326和黄花烟，均为温室培育，采摘其4
‑
6叶期完全伸展开的叶片进行腺毛原生质体制备；根组织材料则采用无菌条件下萌发（K326、本氏烟）生长7
‑
10天的根组织；实验方法：细胞计数法读取原生质体数量时：先取原生质体悬液20
µ
L，加20
µ
L台盼蓝混匀；然后将10μL悬液加入细胞计数板中，静置1分钟，插入细胞计数器计数；读取细胞浓本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种烟草原生质体制备方法，其特征在于，该方法针对烟草根部细胞、或者烟叶细胞的原生质体制备分离应用，具体包括如下步骤：（一）准备酶解液以烟草根尖、或烟叶为原生质体制备材料来源；针对烟草根尖材料时，原生质体制备用酶解液为：含有纤维素酶cellulast、果胶酶pectolyase或离析酶Macerozyme的MES缓冲液；具体配方组成为：MES、5mM+CaC12、10mM+NaCl、10mM+甘露醇Manmitol、0.35M+1.5%纤维素酶cellulast+1.0~1.5%果胶酶pectolyase或离析酶Macerozyme+0.1%BSA；针对烟叶材料时，原生质体制备用酶解液为：含有cellulast和离析酶Macerozyme的CPW缓冲液；具体配方组成为：缓冲液CPW+Manmitol、0.4M+1%cellulast+0.5%Macerozyme；所述缓冲液CPW：KH2PO4、27.2mg/L+KNO3、101.0mg/L+CaCl2•
2H2O、1480.0mg/L+MgSO4•
7H2O、246.0mg/L+KI、0.16mg/L+CuSO4•
5H2O、0.025mg/L；（2）材料预处理以无菌培养的烟草、或新鲜烟叶为原生质体制备材料来源；预处理时：针对根组织，取烟草发芽生长7
‑
10天的根尖组织，无菌水清洗后，...

【专利技术属性】
技术研发人员：权利要求书一页说明书五页附图三页，
申请(专利权)人：中国烟草总公司郑州烟草研究院，
类型：发明
国别省市：