一种虎杖悬浮细胞、其外泌体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于植物外泌体技术领域，公开了一种虎杖悬浮细胞、其外泌体及其制备方法和应用。本发明专利技术首次以虎杖愈伤组织为原材料，通过独特的培养方式，并利用凝胶层析色谱柱分离技术，成功获得虎杖外泌体。本发明专利技术所获得虎杖外泌体具有较好的细胞修复能力，可促进细胞划痕修复和细胞增殖，适用于需要具有细胞修复能力的药品、医美产品或护肤品中。医美产品或护肤品中。医美产品或护肤品中。

【技术实现步骤摘要】
一种虎杖悬浮细胞、其外泌体及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及植物外泌体
，具体涉及一种虎杖悬浮细胞、其外泌体及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]植物外泌体具有多种特殊功效。如姜的外泌体样纳米颗粒(ginger exosome
‑
like nanoparticles，GELN)可被肠道细菌摄取，易被乳杆菌吸收，所含的miRNA可直接调控特定细菌的基因表达和代谢物，从而影响菌群组成和宿主生理，增强宿主肠道屏障功能来缓解小鼠的结肠炎。Sahin等人的研究结果表明，小麦外泌体对内皮细胞、上皮细胞和真皮成纤维细胞具有促增殖和迁移作用，增加了内皮细胞的管状结构形成，增强伤口愈合相关基因的表达，修饰协调血管的形成，促进伤口愈合。防风草来源的外泌体在抗氧化、抗炎、促进细胞增殖和迁移等方面均具有显著作用。
[0003]目前，植物来源外泌体的提取方式主要通过植物组织匀浆破碎，超高速离心法等过程提取。例如，在提取生姜类外泌体时，将粗滤过的生姜汁在低温条件下以高速离心，取上清液重复多次除去细胞碎片，再超高速离心沉淀得到生姜类外泌体。鱼腥草叶片来源类外泌体冻干粉采用鱼腥草叶片匀浆、离心，超滤浓缩冻干制备而成。如中国专利技术专利文献CN202010037118.7公开了一种植物来源外泌体及其制备方法和应用，其通过超高速离心方法提取了干槐米中的外泌体。中国专利技术专利文献CN202110131924.5通过超高速离心的方法提取了雪绒花愈伤组织、滨海剌芹愈伤组织、海茴香愈伤组织中的外泌体。
>[0004]然而，超高速离心方法在植物外泌体的制备时存在如下问题：(1)因植物破碎液中存在大量的杂质干扰，且植物破碎液极易氧化，在氧化过程中会伴随着颜色变化及沉淀产生，超速离心提取时会产生干扰，且易产生杂质，外泌体纯度低。(2)超速离心设备昂贵，且分离效率低。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种虎杖悬浮细胞、其外泌体及其制备方法和应用。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案如下：
[0007]第一方面，本专利技术提供一种虎杖悬浮细胞的制备方法，包括以下步骤：
[0008](1)取虎杖叶片，清洗、消毒，裁成小块，放置于固体诱导培养基中培养，得愈伤组织；
[0009](2)取所述愈伤组织裁成小块，放入液体诱导培养基中培养，过滤去除聚集成团组织，即得悬浮细胞滤液；
[0010](3)将所述悬浮细胞滤液接种至悬浮培养基中继代培养，即得虎杖悬浮细胞；
[0011]所述悬浮培养基为含有1.0mg/L
‑
3.0mg/L2,4
‑
D、0.5mg/L
‑
2mg/L KT的液体MS培养基。
[0012]作为本专利技术所述虎杖悬浮细胞的制备方法的优选实施方式，所述步骤(1)中，所述培养的条件为25℃
±
2℃、黑暗环境；培养时间为3
‑
4周。
[0013]作为本专利技术所述虎杖悬浮细胞的制备方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，所述诱导培养基为含有20g/L
‑
40g/L蔗糖、1.0mg/L
‑
3.0mg/L 2,4
‑
D、0.5mg/L
‑
2mg/L KT、0.5mg/L
‑
1.0mg/L 6
‑
BA的MS培养基；所述MS培养基的pH值为5.6
‑
6.0；所述培养的条件为25℃
±
2℃、黑暗环境；培养时间为3周
‑
4周；转速为120rpm
‑
150rpm。
[0014]作为本专利技术所述虎杖悬浮细胞的制备方法的优选实施方式，所述步骤(3)中，所述接种的接种量为0.5％
‑
1.5％；所述MS培养基的pH值为5.6
‑
6.0；所述培养的条件为25℃
±
2℃、黑暗环境；培养时间为1
‑
2周；转速为100rpm
‑
120rpm。
[0015]优选的，所述小块的大小为(0.4cm
‑
0.6cm)
×
(0.4cm
‑
0.6cm)。
[0016]第二方面，本专利技术提供一种虎杖悬浮细胞的扩大培养方法，包括以下步骤：
[0017](1)取所制备的虎杖悬浮细胞接种所述悬浮培养基中扩大培养；
[0018](2)培养至4天
‑
6天时，流加补料，所述补料为碳源、氮源、微量元素；
[0019](3)培养至7天
‑
8天时，加入0.08％
‑
0.4％H2O2；
[0020](4)继续培养15天
‑
20天，即成。
[0021]作为本专利技术所述虎杖悬浮细胞扩大培养方法的优选实施方式，所述步骤(1)中，所述接种的接种量为1％
‑
10％；所述培养的条件为25℃
±
2℃，转速为100rpm
‑
300rpm。
[0022]作为本专利技术所述虎杖悬浮细胞扩大培养方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，所述碳源为50％葡萄糖溶液；所述氮源为10g/L NH4NO3；所述微量元素为1.0g H3BO3、2.0g MnSO4·
4H2O、0.5g ZnSO4·
7H2O、0.03g Na2MoO4·
2H2O、1mg CuSO4·
5H2O、1mg CoCl2·
6H2O；所述补料采用阶段补料方式，每22h
‑
26h补料一次，每次补料量逐级增加，初始补料量为培养体积的0.8％
‑
1.2％。
[0023]第三方面，本专利技术提供一种由上述方法制备或培养的虎杖悬浮细胞。
[0024]第四方面，本专利技术提供一种虎杖外泌体的提取方法，包括以下步骤：
[0025](1)取所述虎杖悬浮细胞，离心收集上清液；再次离心收集上清液；
[0026](2)0.22μm滤膜过滤所述上清液，得滤液；
[0027](3)取所述滤液经超滤膜包和/或中空纤维超滤膜处理，得浓缩滤液；
[0028](4)将所述浓缩滤液经凝胶层析色谱柱处理，收集样品峰，即得。
[0029]作为本专利技术所述的虎杖外泌体的提取方法的优选实施方式，所述步骤(1)中，所述离心的转速为3000rpm
‑
4000rpm，时间为30min
‑
60min；所述再次离心的转速为9000
‑
12000rpm，时间为30min
‑
60min。
[0030]作为本专利技术所述的虎杖外泌体的提取方法的优选实施方式，所述步骤(3)中，所述超滤膜包和中空纤维超滤膜截留分子量为100KDa
‑<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种虎杖悬浮细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取虎杖叶片，清洗、消毒，裁成小块，放置于固体诱导培养基中培养，得愈伤组织；(2)取所述愈伤组织裁成小块，放入液体诱导培养基中培养，过滤去除聚集成团组织，即得悬浮细胞滤液；(3)将所述悬浮细胞滤液接种至悬浮培养基中继代培养，即得虎杖悬浮细胞；所述悬浮培养基为含有1.0mg/L
‑
3.0mg/L2,4
‑
D、0.5mg/L
‑
2mg/L KT的液体MS培养基。2.根据权利要求1所述虎杖悬浮细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述诱导培养基为含有20g/L
‑
40g/L蔗糖、1.0mg/L
‑
3.0mg/L 2,4
‑
D、0.5mg/L
‑
2mg/L KT、0.5mg/L
‑
1.0mg/L 6
‑
BA的MS培养基；所述MS培养基的pH值为5.6
‑
6.0；所述培养的条件为25℃
±
2℃、黑暗环境；培养时间为3周
‑
4周。3.一种虎杖悬浮细胞的扩大培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取权利要求1或2所制备的虎杖悬浮细胞接种所述悬浮培养基中扩大培养；(2)培养至4天
‑
6天时，流加补料，所述补料为碳源、氮源、微量元素；(3)培养至7天
‑
8天时，加入0.08％
‑
0.4％H2O2；(4)继续培养15天
‑
20天，即成。4.根据权利要求3所述虎杖悬浮细胞的扩大培养方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述碳源为50％葡萄糖溶液；所述氮源为10g/L NH4...

【专利技术属性】
技术研发人员：周晗，陈玉容，陈宁，范航，赖云，来昌冲，
申请(专利权)人：广州远想生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：