构建虎杖STS基因过表达载体提高白藜芦醇和虎杖苷含量的方法技术

本申请提出一种构建虎杖STS基因过表达载体提高白藜芦醇和虎杖苷含量的方法，包括：构建STS表达载体，通过发根农杆菌导入pCa－STS载体并整合进虎杖基因组，使STS基因过表达，从而获得转STS基因的虎杖毛状根，以正向调控虎杖根中白藜芦醇和虎杖苷的生物合成速率，提高白藜芦醇和虎杖苷的含量。本申请以虎杖自身编码的调控白藜芦醇和虎杖苷合成的关键基因STS，用于基因的克隆以及过表达载体pCa－STS的构建。其中白藜芦醇和虎杖苷含量相比于野生型毛状根分别提高了408.3ug/g、1440.02ug/g。本申请可为高效、大量获得白藜芦醇及其相关代谢物提供一种简单、有效的途径。有效的途径。

【技术实现步骤摘要】
构建虎杖STS基因过表达载体提高白藜芦醇和虎杖苷含量的方法


[0001]本申请涉及一种生物
，尤其涉及一种构建虎杖STS基因过表达载体提高白藜芦醇和虎杖苷含量的方法。

技术介绍

[0002]虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb.etZucc.)又名斑杖、苦杖，属于多年生蓼科草本植物，主要分布于陕西、四川、甘肃等地，多生长于阴湿地，主要药用部位为其干燥根茎，根茎呈节段，横卧地下，木质，黄褐色，富含大量白藜芦醇(Resveratrol)、虎杖苷(Polydatin)、大黄素(Emodin)等药用成分，有抗癌、延缓衰老、增强免疫、治疗炎症等功效，广泛应用于医药保健领域。虎杖于每年3至4月份开始长出紫红色嫩芽，10d后开始分支，嫩芽逐渐形成直立茎，表面有紫红色斑点，茎中空，呈圆柱形，可生长高至1～3m，花期为7～9月，10月果实成熟，11月地上部分枯萎，直至次年3月从地下根茎中再次发芽。
[0003]虎杖中富含白藜芦醇、虎杖苷、木质素、橡胶素、单宁和类黄酮等物质，其中白藜芦醇和虎杖苷属于二苯乙烯类化合物，也是植物中最大的一类特化代谢物，富含于虎杖根及其根茎中，可抵御生物和非生物胁迫，如病原体攻击、受伤、紫外、臭氧等。虎杖苷又称白藜芦醇苷，是《中国药典》中规定的虎杖指标性成分之一，是白藜芦醇在葡萄糖基转移酶作用下转化生成，虎杖苷也可在糖苷酶作用下分解为白藜芦醇而发挥药理作用。白藜芦醇和白藜芦醇苷均含有顺反异构体，反式白藜芦醇有更强的生物活性。近年来，白藜芦醇作为植物抗毒素引起了人们的关注，可由有限数量的分类上不相关的物种(包括虎杖、葡萄、花生和松树等)产生，对膝盖关节炎、糖尿病、肝损伤、急性肾损伤、肺癌等疾病有显著改善作用。然而天然白藜芦醇主要以虎杖苷的形式存在于虎杖植物中，白藜芦醇在植物中的含量很少，目前获得高含量白藜芦醇的方法主要依靠生物酵解。其中，虎杖鲜根中的白藜芦醇含量高于鲜茎，鲜叶中几乎不含白藜芦醇。
[0004]通过插入外源基因或调控内源基因的表达来调整次生代谢物的合成，是获取高含量目标次生代谢物的重要手段。虎杖的主要活性成分是白藜芦醇和虎杖苷，属于二苯乙烯类化合物，是通过苯丙氨酸途径合成，该途径受多种酶调节，其中二苯乙烯合酶(STS)是该途径的关键限速酶，与CHS基因共同竞争相同底物，可催化对香豆酸和丙二酰辅酶A合成白藜芦醇，增强STS基因的表达可能正向调控白藜芦醇的生物合成。植物转基因方法主要有基因枪法、花粉管通道法、农杆菌侵染法等，由农杆菌介导的遗传转化方法是相对简单、高效、成熟的体系。
[0005]虎杖苷和白藜芦醇均是有益于人类健康的多酚类化合物，天然植物中提取的白藜芦醇和虎杖苷不能满足人们对它的需求。目前对于提高白藜芦醇和虎杖苷的方法多数是通过改进提取方法获得，鲜少报道改造虎杖内源基因表达来提高次生代谢物含量。

技术实现思路

[0006]本申请实施例提供一种构建虎杖STS基因过表达载体提高白藜芦醇和虎杖苷含量的方法，以解决相关技术存在的问题，技术方案如下：
[0007]本申请实施例提供了一种构建虎杖STS基因过表达载体提高白藜芦醇和虎杖苷含量的方法，包括：
[0008]构建STS表达载体，通过发根农杆菌导入pCa－STS载体并整合进虎杖基因组，使STS基因过表达，从而获得转STS基因的虎杖毛状根，以正向调控虎杖根中白藜芦醇和虎杖苷的生物合成速率，提高白藜芦醇和虎杖苷的含量。
[0009]在一种实施方式中，所述构建STS表达载体，包括：
[0010]步骤1，提取新鲜虎杖嫩叶RNA，用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性并用微量紫外分光光度计检测RNA浓度与纯度，然后以RNA为模板进行反转录得到cDNA，并用带酶切位点的特异性引物对cDNA进行PCR，电泳并回收目标片段；
[0011]步骤2，将回收的目标片段与pTOPO载体连接，冻融法导入大肠杆菌DH5a感受态细胞，随后取200uL菌液涂布在含100ug/mL氨苄青霉素抗性的LB固体培养基上，37℃过夜培养，接种单菌落接种在含有100ug/mL氨苄青霉素抗性的LB液体培养液中，在37℃下，200rpm过夜培养；
[0012]步骤3，使用限制性内切酶酶切获得STS基因和pCambia1301线性载体，酶切结束后进行1％琼脂糖凝胶电泳并回收目的基因；
[0013]步骤4，使用碱性磷酸酶对5
’
端进行去磷酸化处理以防止载体自连，利用T4连接酶将载体pCambia1301和STS基因过夜连接，获得pCa－STS载体。
[0014]在一种实施方式中，所述通过发根农杆菌导入pCa－STS载体并整合进虎杖基因组，使STS基因过表达，还包括：
[0015]步骤5，将重组质粒pCa－STS使用冻融法转化大肠杆菌感受态，取200uL菌液涂布在含50ug/mL卡那霉素抗性的LB固体培养基上，37℃过夜培养，挑取平板上生长的单菌落分别接种在5mL含50ug/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基的试管中，在37℃下，200rpm振荡培养12h，以目的基因序列为正向引物，载体序列为反向引物，分别取10uL菌液进行菌液PCR，确保目的基因为正向插入，同时取PCR为阳性的菌液3mL提取质粒并测序验证；
[0016]步骤6，取1mL过夜培养的发根农杆菌菌液，转接于100mL YEB液体培养基中，在28℃摇床上180rpm剧烈振荡培养约6h，检测其600nm处的吸光度值为0.6时，取2mL菌液于离心管中冰浴30min，然后4℃下，3000rpm离心10min，弃上清，加入1mL冰上预冷的0.1M CaCl2，反复吹打使细胞充分悬浮后冰浴60min，4℃，3000rpm离心5min，弃上清，加入0.1M CaCl
2 500uL，以100uL每管分装，－80℃贮藏；
[0017]步骤7，取100uL发根农杆菌感受态细胞，加入10uL重组质粒pCa－STS，轻轻敲打管壁混匀，冰浴5min，42℃热激60s，冰浴5min，加入无抗YEB液体培养基500uL，在28℃下，180rpm振荡培养45min，随后取200uL菌液涂布在含50ug/mL卡那霉素抗性的YEB固体培养基上，28℃过夜培养，获得改造后的发根农杆菌。
[0018]在一种实施方式中，所述获得转STS基因的虎杖毛状根，包括：
[0019]取改造后的发根农杆菌侵染虎杖外植体；
[0020]将外植体浸于菌液浓度达A600＝0.5的发根农杆菌菌液中，180W超声处理10s，39
℃水浴热侵染5min，对照组使用野生型发根农杆菌ATCC15834侵染；
[0021]随后吸干外植体表面菌液并接种于1/2MS培养基，在25℃培养间暗培养；
[0022]将虎杖毛状根从外植体上剪下，接种于含有1mg/L NAA的1/2MS液体培养基中，在25℃，110rpm摇床中暗培养30d。
[0023]在一种实施方式中，步骤1中，所述特异性引物为STS－F1：5...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种构建虎杖STS基因过表达载体提高白藜芦醇和虎杖苷含量的方法，其特征在于，包括：构建STS表达载体，通过发根农杆菌导入pCa－STS载体并整合进虎杖基因组，使STS基因过表达，从而获得转STS基因的虎杖毛状根，以正向调控虎杖根中白藜芦醇和虎杖苷的生物合成速率，提高白藜芦醇和虎杖苷的含量。2.根据权利要求1所述的构建虎杖STS基因过表达载体提高白藜芦醇和虎杖苷含量的方法，其特征在于，所述构建STS表达载体，包括：步骤1，提取新鲜虎杖嫩叶RNA，用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性并用微量紫外分光光度计检测RNA浓度与纯度，然后以RNA为模板进行反转录得到cDNA，并用带酶切位点的特异性引物对cDNA进行PCR，电泳并回收目标片段；步骤2，将回收的目标片段与pTOPO载体连接，冻融法导入大肠杆菌DH5a感受态细胞，随后取200uL菌液涂布在含100ug/mL氨苄青霉素抗性的LB固体培养基上，37℃过夜培养，接种单菌落接种在含有100ug/mL氨苄青霉素抗性的LB液体培养液中，在37℃下，200rpm过夜培养；步骤3，使用限制性内切酶酶切获得STS基因和pCambia1301线性载体，酶切结束后进行1％琼脂糖凝胶电泳并回收目的基因；步骤4，使用碱性磷酸酶对5
’
端进行去磷酸化处理以防止载体自连，利用T4连接酶将载体pCambia1301和STS基因过夜连接，获得pCa－STS载体。3.根据权利要求2所述的构建虎杖STS基因过表达载体提高白藜芦醇和虎杖苷含量的方法，其特征在于，所述通过发根农杆菌导入pCa－STS载体并整合进虎杖基因组，使STS基因过表达，包括：步骤5，将重组质粒pCa－STS使用冻融法转化大肠杆菌感受态，取200uL菌液涂布在含50ug/mL卡那霉素抗性的LB固体培养基上，37℃过夜培养，挑取平板上生长的单菌落分别接种在5mL含50ug/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基的试管中，在37℃下，200rpm振荡培养12h，以目的基因序列为正向引物，载体序列为反向引物，分别取10uL菌液进行菌液PCR，确保目的基因为正向插入，同时取PCR为阳性的菌液3mL提取质粒并测序验证；步骤6，取1mL过夜培养的发根农杆菌菌液，转接于100mL YEB液体培养基中，在28℃摇床上180rpm剧烈振荡培养约6h，检测其600nm处的吸光度值为0.6时，取2mL菌液于离心管中冰浴30min，然后4℃下，3000rpm离心10min，弃上清，加入1mL冰上预冷的0.1M CaCl2，反复吹打使细胞充分悬浮后冰浴60min，4℃，3000rpm离心5min，弃上清，加入0.1M CaCl
2 500uL，以100uL每管分装，－80℃贮藏；步骤7，取100uL发根农杆菌感受态细胞，加入10uL重组质粒pCa－STS，轻轻敲打管壁混匀，冰浴5min，42℃热激60s，冰浴5min，加入无抗YEB液体培养基500uL，在28℃下，180rpm振荡培养45min，随后取200uL菌液涂布在含50ug/mL卡那霉素抗性的YEB固体培养基上，28℃过夜培养，获得改造后的发根农杆菌。4.根据权利要求3所述的构建虎杖S...

【专利技术属性】
技术研发人员：范航，邹衡芳，白海怡，来昌冲，
申请(专利权)人：广州远想生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：