一种快速高密度培养沙漠蔷薇悬浮细胞高产绿原酸的方法技术

本发明专利技术属于植物组织培养类的化妆品原料领域，公开了一种快速高密度培养沙漠蔷薇悬浮细胞高产绿原酸的方法。该方法包括无菌叶片的获得、愈伤组织诱导、愈伤组织的继代增殖、悬浮细胞的培养和筛选，规模性放大培养，高产绿原酸诱导。该方法以沙漠蔷薇植株新鲜幼嫩叶片为外植体，可快速诱导细胞脱分化形成愈伤组织，愈伤组织经过固体继代及液体震荡培养，筛选获得可进行高密度悬浮培养细胞系，其可以在一个培养周期内，约5～7天沙漠蔷薇悬浮细胞鲜重就达到600

【技术实现步骤摘要】
一种快速高密度培养沙漠蔷薇悬浮细胞高产绿原酸的方法


[0001]本专利技术属于植物组织培养类的化妆品原料领域，特别涉及一种快速高密度培养沙漠蔷薇悬浮细胞高产绿原酸的方法。

技术介绍

[0002]沙漠蔷薇(Adenium Obesum.)，又名沙漠玫瑰，天宝花，是夹竹桃科沙漠玫瑰属，为多年生落叶肉质植物，原产东非至阿拉伯半岛南部，该地区地处赤道附近，常年干旱少雨，光照充足。特殊的地理环境造成沙漠蔷薇喜高温干燥和阳光充足的环境，耐酷暑，耐干旱，能在恶劣的环境中生长，能够从干燥的沙漠环境中获取水分，有很强的保水能力。
[0003]沙漠蔷薇提取物有很好的药用价值和美容功效，沙漠蔷薇中可提取出30种强心苷和2种孕烷，可用于治疗心脏病和妇科病。沙漠蔷薇叶提取物具有保湿润肤，抗衰老等美容功效。沙漠蔷薇花提取物含高浓度海藻糖，有减少晒黑和皮肤老化、有效提高肌肤的储水功能。
[0004]沙漠蔷薇自花结实率低，不容易长果荚，种子少，收集难；且人工授粉较难，操作成功率低，一般是用半成熟枝扦插来栽培，但繁殖速度慢，易出现根腐病。因此，依靠种植实生苗或扦插苗提取功效成分，存在资源不足的问题。
[0005]专利CN 104622759 A中指出原料沙漠蔷薇叶细胞提取物的常规制备方法是利用新鲜、无杂质的沙漠蔷薇叶经水蒸气蒸馏法获得，但得率非常低，仅有万分之三。
[0006]专利CN 111280063 A利用沙漠蔷薇成熟种子萌发为无菌苗，以无菌苗的茎、叶片和根为外植体获得愈伤组织，得到沙漠蔷薇悬浮细胞系，进行规模化培养，解决了沙漠蔷薇细胞产量不足的问题。但是，该专利是利用种子作为外植体，而沙漠蔷薇存在种子少，收集难问题，同时，需要种子进行萌发获得无菌苗，再进行愈伤组织诱导，操作繁琐，周期长。并且放大生产需要利用到CN103224882A或CN204385208U的中国专利文献所披露的昂贵生物反应器，致使其进一步应用受到制约。

技术实现思路

[0007]为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本专利技术的目的在于提供一种快速高密度培养沙漠蔷薇悬浮细胞高产绿原酸的方法；该方法以沙漠蔷薇植株新鲜幼嫩叶片为外植体，可快速诱导细胞脱分化形成愈伤组织，愈伤组织经过固体继代及液体震荡培养，筛选获得可进行高密度悬浮培养细胞系，其可以在一个培养周期内，约5～7天沙漠蔷薇悬浮细胞鲜重就达到600
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800g/L；本专利技术悬浮细胞生长速度快、可耐受高转速、可实现高密度培养，使得该技术具有耗时短、成本低，获得的悬浮细胞密度高等特点。
[0008]本专利技术目的通过以下技术方案实现：
[0009]一种快速高密度培养沙漠蔷薇悬浮细胞高产绿原酸的方法，包括无菌叶片的获得、愈伤组织诱导、愈伤组织的继代增殖、悬浮细胞的培养和筛选，规模性放大培养，高产绿原酸诱导。
[0010]一种快速高密度培养沙漠蔷薇悬浮细胞高产绿原酸的方法，具体包括以下操作步骤：
[0011](1)取沙漠蔷薇的幼嫩叶片，按照常规的消毒方法对其进行消毒处理；
[0012](2)将步骤(1)灭菌处理过的叶片切除叶边缘，横切过叶中脉，切成2～3cm见方小块接入诱导培养基中进行诱导培养，温度24℃，湿度70～80％，避光暗培养；
[0013](3)将步骤(2)诱导出来的愈伤组织，选取色泽鲜黄的疏松愈伤组织进行继代培养，继代周期为10
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15天/次，培养条件光照强度1000～1500LX，16h光照/8h黑暗，温度24℃，湿度70％～80％；所述继代培养的培养基配方为：MS+2,4
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D(2,4
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二氯苯氧乙酸)1～4mg/L+6
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BA(6
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苄氨基嘌呤)0.5～2mg/L+TDZ(噻苯隆)0.005～0.05mg/L+蔗糖10～30g/L+琼脂6g/L，pH5.8；
[0014](4)取步骤(3)继代培养2～3次的愈伤组织，选择分散性好、增殖速度快的鲜黄色愈伤组织，用镊子夹碎后转入液体培养基震荡培养，接种量10
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25％，每250mL三角瓶接种80ml悬浮细胞液，培养条件为避光或暗光，温度28℃，震荡培养5～7天后进行悬浮细胞继代培养，继代次数3～5次，得到高分散悬浮细胞；
[0015]所述震荡培养和悬浮细胞继代培养使用的培养基均为液体培养基，具体由以下组分组成：MS+2,4
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D 1～4mg/L+6
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BA 0.1～1mg/L+TDZ 0.01～0.1mg/L+蔗糖30g/L+胰蛋白胨100～500mg/L+苯丙氨酸50～500mg/L，pH5.8；
[0016]所述震荡培养的第1天摇床转速为80～120rpm，自培养第3天开始摇床速度在150～220rpm的范围内逐步提高搅拌速度；
[0017](5)将步骤(4)筛选获得的高分散悬浮细胞，按10％接种量接种至带有曝气装置10L波浪式生物反应器进行扩大培养，设定参数：温度25～28℃，转速80～120rpm，pH5.5～6.0，DO值为3％～10％，培养期间，每天取细胞培养液样品，考察细胞密度和细胞活率变化情况，以及上清液中绿原酸含量变化。
[0018]步骤(1)中所述消毒方法具体按照以下步骤：取沙漠蔷薇的幼嫩叶片，清洗表面污渍，流水冲洗30～50min，超净工作台内无菌室清洗2～3遍，用体积百分浓度70％的酒精浸泡30s，再用无菌水清洗3～4遍，然后用含5％有效率的次氯酸钠溶液处理8～15min，无菌水清洗3～4遍，无菌滤纸吸干叶片表面水分。采用此方法消毒后的组织，染菌几率小于1
‰
。
[0019]步骤(2)中所述诱导培养基的配方为MS+NAA(α
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萘乙酸)0.1～1mg/L+6
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BA 1～2mg/L，附加蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，pH5.8；所述诱导培养的时间为7
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10天，叶片边缘会诱导产生愈伤组织，诱导率>90％。附加蔗糖和琼脂可以显著促进愈伤组织产生。
[0020]步骤(3)中所述继代培养的培养基中的蔗糖浓度优选为30g/L，其利于获得颗粒细小，疏松易碎的愈伤组织用于悬浮培养。
[0021]步骤(4)中所述悬浮细胞继代培养时，高分散悬浮细胞的筛选方法为：首先将震荡培养所得悬浮细胞培养液摇匀后静置1min，使用大口吸管吸取上层细胞，去除较大颗粒细胞团，收集细胞液通过300～500g离心5min，去除细胞碎片，获得的细胞液与新鲜液体培养液按照1:1～3接种量进行继代，经过3～5次继代培养后，悬浮培养液中主要由单细胞和小细胞团组成，即得到高分散悬浮细胞。所得高分散悬浮细胞分散均匀，生长活力旺盛。
[0022]将步骤(4)所得高分散悬浮细胞进行高密度培养，细胞培养密度>5*104个/ml，生长曲线呈S型，培养5～7天后，悬浮细胞湿重量达到500
‑
800g/L。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速高密度培养沙漠蔷薇悬浮细胞高产绿原酸的方法，其特征在于具体包括以下操作步骤：(1)取沙漠蔷薇的幼嫩叶片，按照常规的消毒方法对其进行消毒处理；(2)将步骤(1)灭菌处理过的叶片切除叶边缘，横切过叶中脉，切成2～3cm见方小块接入诱导培养基中进行诱导培养，温度24℃，湿度70～80％，避光暗培养；(3)将步骤(2)诱导出来的愈伤组织，选取色泽鲜黄的疏松愈伤组织进行继代培养，继代周期为10
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15天/次，培养条件光照强度1000～1500LX，16h光照/8h黑暗，温度24℃，湿度70％～80％；所述继代培养的培养基配方为：MS+2,4
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D 1～4mg/L+6
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BA 0.5～2mg/L+TDZ 0.005～0.05mg/L+蔗糖10～30g/L+琼脂6g/L，pH5.8；(4)取步骤(3)继代培养2～3次的愈伤组织，选择分散性好、增殖速度快的鲜黄色愈伤组织，用镊子夹碎后转入液体培养基震荡培养，接种量10
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25％，每250mL三角瓶接种80ml悬浮细胞液，培养条件为避光或暗光，温度28℃，震荡培养5～7天后进行悬浮细胞继代培养，继代次数3～5次，得到高分散悬浮细胞；所述震荡培养和悬浮细胞继代培养使用的培养基均为液体培养基，具体由以下组分组成：MS+2,4
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D 1～4mg/L+6
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BA 0.1～1mg/L+TDZ 0.01～0.1mg/L+蔗糖30g/L+胰蛋白胨100～500mg/L+苯丙氨酸50～500mg/L，pH5.8；所述震荡培养的第1天摇床转速为80～120rpm，自培养第3天开始摇床速度在150～220rpm的范围内逐步提高搅拌速度；(5)将步骤(4)筛选获得的高分散悬浮细胞，按10％接种量接种至带有曝气装置10L波浪式生物反应器进行扩大培养，设定参数：温度25～28℃，转速80～120rpm，pH5.5～6.0，DO值为3％～10％，培养期间，每天取细胞培养液样品，考察细胞密度和细胞活率变化情况，以及上清液中绿原酸含量变化。2.根据权利要求1所述的一种快速高密度培养沙漠...

【专利技术属性】
技术研发人员：周爱梅，张齐，肖巧学，黄卓琼，
申请(专利权)人：肽源广州生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：