曲霉菌的引物探针组合及应用、PCR反应液制造技术

本发明专利技术提供一种曲霉菌的引物探针组合及应用、PCR反应液，所述曲霉菌的引物探针组合用于检测四种曲霉菌，包括第一引物探针组合和第二引物探针组合，核苷酸序列如SEQ ID NO：1

【技术实现步骤摘要】
曲霉菌的引物探针组合及应用、PCR反应液


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及曲霉菌的引物探针组合及应用、PCR反应液。

技术介绍

[0002]侵袭性曲霉病(Invasive Aspergillosis，IA)常常在重症患者机体深部感染，多数为肺部受累，由于起病隐匿、临床表现不典型，临床诊断较为困难，导致IA病死率高。目前临床上仍缺乏IA特异性的分子生物学检测方法，建立快速检测常见致病性曲霉的方法，可早期获得检测结果可指导临床及时釆取适当治疗方案。
[0003]目前国内外均有采用荧光定量PCR(qPCR)技术检测临床样本中的曲霉菌的报道，其灵敏度检测限为101‑
102CFU/mL，但临床样本中曲霉菌的含量往往低于其下限，导致出现一部分的假阴性。因此，常规qPCR检测技术已难以满足临床对灵敏度的需求，尤其是对于感染早期或微量样本的检测仍存在局限性。
[0004]数字PCR(ddPCR)是本世纪崛起的第三代PCR技术，以高灵敏度、尤其是针对微量样本DNA检测著称。ddPCR可以无需依赖于对照样品和标准曲线就可以进行精确的绝对定量检测，不需要检测荧光信号与设定阈值线的交点，完全不依赖于Ct值的鉴定，同时反应受扩增效率的影响大大降低，对PCR反应抑制物的耐受能力大大提高，可以极大程度上降低与目标序列有竞争性作用的背景序列浓度，直接计算给出待检靶分子的浓度或拷贝数。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术中的缺点与不足，提供一种曲霉菌的引物
[0006]探针组合，分别针对四种曲霉菌，设计出对目的区域扩增的引物和探针，具有良好的扩增特异性和高灵敏度。
[0007]本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0008]一种曲霉菌的引物探针组合，包括第一引物探针组合和第二引物探针组合；
[0009]所述第一引物探针组合包括针对烟曲霉菌的第一上游引物、第一下游引物和第一探针，以及针对土曲霉菌的第二上游引物、第二下游引物和第二探针；第一上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，第一下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示,第一探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；第二上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，第二下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示,第二探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
[0010]所述第二引物探针组合包括针对黄曲霉菌的第三上游引物、第三下游引物和第三探针，以及针对黑曲霉菌的第四上游引物、第四下游引物和第四探针；第三上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，第三下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示,第三探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；第四上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示，第四下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO:11所示,第四探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。
[0011]本专利技术提供的曲霉菌的引物探针组合，分别针对四种曲霉菌内保守区域，设计并筛选得到进行特异性扩增的引物和探针，所述曲霉菌的引物探针组合在对曲霉菌进行扩增
时，将所述曲霉菌的引物探针组合分成第一引物探针组合和第二引物探针组合，分别进行扩增，减小了不同引物之间的相互作用，提高了扩增的特异性和灵敏度。
[0012]本专利技术还提供上述的曲霉菌的引物探针组合在PCR扩增和曲霉菌检测领域的应用。本专利技术所述的曲霉菌的引物探针组合，在PCR扩增例如数字PCR扩增、实时荧光定量PCR或普通PCR等扩增技术中均可应用，在得到扩增产物后进行曲霉菌的检测。
[0013]本专利技术还提供一种PCR反应液，包括PCR预混液和上述的曲霉菌的引物探针组合；所述引物探针组合的第一上游引物、第一下游引物、第二上游引物、第二下游引物、第三上游引物、第三下游引物、第四上游引物和第四下游引物的浓度为16
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24μm/L；所述引物探针组合的第一探针、第二探针、第三探针和第四探针的浓度为8
‑
12μm/L。
[0014]所述PCR反应液应用于PCR扩增时，加入核酸模板进行扩增，减小了不同引物之间的相互作用，提高了扩增的特异性和灵敏度，引物和探针的浓度影响PCR扩增的扩增效率，设置合适的浓度，提高扩增的特异性和效率。
[0015]为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本专利技术。
附图说明
[0016]图1是实施例1中烟曲霉菌分子拷贝数与样本浓度的线性关系图；
[0017]图2是实施例1中土曲霉菌分子拷贝数与样本浓度的线性关系图；
[0018]图3是实施例1中黄曲霉菌分子拷贝数与样本浓度的线性关系图；
[0019]图4是实施例1中黑曲霉菌分子拷贝数与样本浓度的线性关系图。
具体实施方式
[0020]下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本专利技术的技术方案，但下述的实施例仅仅是本专利技术的一般例子，并不代表或限制本专利技术的权利保护范围，本专利技术的保护范围以权利要求书为准。
[0021]以下实施例中，若无特殊说明，所用的试剂均可购自本领域常规的厂商；所用的实验方法均为本领域技术人员熟知的实验方法。
[0022]实施例1
[0023]本实施例1提供一种曲霉菌的引物探针组合。
[0024]从NCBI上搜索到烟曲霉菌、土曲霉菌、黄曲霉菌和黑曲霉菌不同亚种的参考基因组序列，通过生物信息学比较基因组的方法进行多序列比对，寻找不同菌种特异性的序列。基于上述分析得到的特异性序列，利用primer软件设计引物和探针，引物包括上游引物和下游引物。根据引物设计原理，分别针对针对烟曲霉菌、土曲霉菌、黄曲霉菌和黑曲霉菌，设计2
‑
3对引物和探针。合成引物和探针，并采用PCR技术对引物和探针组合进行测试，发现引物会影响扩增片段的长度，且使用不同引物扩增的效率不同，从而影响后续定量检测曲霉菌的灵敏度。
[0025]经过设计及测试，筛选出曲霉菌的引物探针组合如表1
‑
1所示。
[0026]表1
‑
1定量检测四种曲霉菌的引物探针组合
[0027][0028][0029]所述曲霉菌的引物探针组合包括第一引物探针组合和第二引物探针组合；
[0030]所述第一引物探针组合包括针对烟曲霉菌的第一上游引物、第一下游引物和第一探针，以及针对土曲霉菌的第二上游引物、第二下游引物和第二探针；
[0031]所述第二引物探针组合包括针对黄曲霉菌的第三上游引物、第三下游引物和第三探针，以及针对黑曲霉菌的第四上游引物、第四下游引物和第四探针。
[0032]本实施例1还提供一种PCR反应液，所述PCR反应液包括PCR预混液和上述的曲霉菌的引物探针组合，所述引物探针组合的第一上游引物、第一下游引物、第二上游引物、第二下游引物、第三上游引物、第三下游引物、第四上游引物和第四下游引物的浓度为16
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24μm本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种曲霉菌的引物探针组合，其特征在于：包括第一引物探针组合和第二引物探针组合；所述第一引物探针组合包括针对烟曲霉菌的第一上游引物、第一下游引物和第一探针，以及针对土曲霉菌的第二上游引物、第二下游引物和第二探针；第一上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，第一下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示,第一探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；第二上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，第二下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示,第二探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；所述第二引物探针组合包括针对黄曲霉菌的第三上游引物、第三下游引物和第三探针，以及针对黑曲霉菌的第四上游引物、第四下游引物和第四探针；第三上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，第三下游引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：何志捷，李伟超，何铭辉，赖炳权，颜尓聪，林钊，张纪斌，黎新年，
申请(专利权)人：广州永诺医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：