一种基于代谢组学鉴别不同年份不同采收期广陈皮的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于代谢组学鉴别不同年份不同采收期广陈皮的方法，属于中药材分析检测领域。本发明专利技术基于代谢组学鉴别不同年份不同采收期广陈皮获得UPLC

【技术实现步骤摘要】
一种基于代谢组学鉴别不同年份不同采收期广陈皮的方法


本专利技术属于中药材分析检测领域，尤其涉及一种基于代谢组学鉴别不同年份不同采收期广陈皮的方法。

技术介绍

《中华人民共和国药典》(2020版)记载，陈皮药材可分为“陈皮”及“广陈皮”广陈皮主要来源于橘的变种茶枝柑(Citrus reticulata'Chachi')的干燥成熟果皮。茶枝柑主产于广东新会，是广陈皮的主要来源。作为陈皮道地药材的广陈皮具有理气健脾、燥湿化痰的功效。自古以来，其良好的药效已经得到了广泛认可，新会陈皮已成为传统的中药材、广东三宝之首、十大广药之一、岭南八大中药保护品种之一，并成为国家地理标志产品。由此可见，广陈皮具有很高的药用价值，价格也较昂贵，特别是储存年限较长的广陈皮。因此市场上不乏商家以低年份陈皮代替高年份陈皮赚取更高的利润。随着现代药理学和医学的发展，广陈皮的质量控制体系研究尤为迫切。目前对陈皮的质量评价主要是着重于检测其中一个或几个化合物含量为指标判定药材质量的结论过于局限,无法全面地评价药材质量。中国药典通过性状鉴别区分广陈皮，主要以橙皮苷含量作为质量控制的指标。虽然常规性状显微鉴别可以达到一定的效果，但是难免存在一定的主观性和经验依赖性。因此，急需一种快速、有效的分析方法，用干陈皮品质的鉴别及质量评价。

技术实现思路

本专利技术的目的之一在于提供一种基于代谢组学鉴别不同年份不同采收期广陈皮的方法，包括以下步骤：(1)陈皮样品的制备；(2)陈皮样品的检测；(3)陈皮样品化学成分的鉴定；(4)代谢组学数据的处理与分析；所述陈皮样品的检测为色谱
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质谱检测；其中色谱条件为:1)色谱柱：Agilent SB
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C181.8μm，2.1mm*100mm；2)流动相：A相为超纯水(加入0.1％的甲酸)，B相为乙腈(加入0.1％的甲酸)；3)洗脱梯度：0.00minB相比例为5％，9.00min内B相比例线性增加到95％，并维持在95％1min，10.00
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11.10min，B相比例降为5％，并以5％平衡至14min；4)流速0.35mL/min；柱温40℃；进样量2μL。
[0018]质谱条件为:电喷雾离子源(electrospray ionization，ESI)温度500℃；离子喷雾电压(IS)5500V(正离子模式)/
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4500V(负离子模式)；离子源气体I(GSI)，气体II(GSII)和气帘气(CUR)分别设置为50、60和25psi，碰撞诱导电离参数设置为高。QQQ扫描使用MRM模
式，并将碰撞气体(氮气)设置为中等。通过进一步的去簇电压(declustering potential，DP)和碰撞能(collision energy，CE)优化，完成了各个MRM离子对的DP和CE。根据每个时期内洗脱的代谢物，在每个时期监测一组特定的MRM离子对。优选地，陈皮样品的制备步骤为：将样品从
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80℃冰箱中取出，放在冰上解冻后，涡旋30s混匀，取3mL样本进行真空冷冻干燥，加入500μL 70％甲醇内标提取液，涡旋15min；12000r/min，4℃条件下离心3min，移取上清液，用微孔滤膜(0.22μm)过滤后，保存于进样瓶。优选地,基于迈维代谢自建数据库MWDB(metware database)，根据二级谱信息进行物质定性，分析时去除了同位素信号，含K+离子、Na+离子、NH4+离子的重复信号，以及本身是其他更大分子量物质的碎片离子的重复信号。更优选地，代谢物定量是利用三重四级杆质谱的多反应监测模式分析完成。该模式中，四级杆首先筛选目标物质的前体离子(母离子)，排除掉其他分子量物质对应的离子以初步排除干扰；前体离子经碰撞室诱导电离后断裂形成很多碎片离子，碎片离子再通过三重四级杆过滤选择出所需要的一个特征碎片离子，排除非目标离子干扰，使定量更为精确，重复性更好。获得不同样本的代谢物质谱分析数据后，对所有物质色谱峰进行峰面积积分，并对其中同一代谢物在不同样本中的质谱出峰进行积分校正。更优选地，代谢组学数据的处理与分析包括:将步骤(2)获得的不同年份不同采收期广陈皮的检测数据利用软件Analyst 1.6.3处理质谱数据，获得代谢物的保留时间和峰面积数据文件,处理后数据通过R软件进行多元统计分析:通过三重四级杆筛选出每个物质的特征离子，在检测器中获得特征离子的信号强度，利用MultiaQuant软件打开样本下机质谱文件，进行色谱峰的积分和校正工作，每个色谱峰的峰面积代表对应物质的相对含量。本实验共检测到736种黄酮类代谢物，包括黄酮374种，黄酮醇143种，二氢黄酮59种，其它类黄酮43种，异黄酮42种，查耳酮31种，二氢黄酮醇14种，鞣质14种，花青素10种，黄烷醇类6种(图4
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5)。一年青皮与一年红皮差异显著代谢物数目为171种、其中下调代谢物数目为149种、上调代谢物数目为22种；二年青皮与二年红皮差异显著代谢物数目为120种、其中下调代谢物数目为91种、上调代谢物数目为29种；三年青皮与三年红皮差异显著代谢物数目为151种、其中下调代谢物数目为128种、上调代谢物数目为23种；一年皮与二年皮差异显著代谢物数目为258种、其中下调代谢物数目为252种、上调代谢物数目为6种；一年皮与三年皮差异显著代谢物数目为291种、其中下调代谢物数目为285种、上调代谢物数目为6种；二年皮与三年皮差异显著代谢物数目为23种、其中下调代谢物数目为16种、上调代谢物数目为7种。更优选地,代谢物含量数据采用UV(unit variance scaling)处理，通过R软件Complex Heatmap包绘制热图，对代谢物在不同样本间的积累模式进行层次聚类分析(Hierarchical Cluster Analysis，HCA)。本专利技术的目的之二在于提供可用于鉴别不同年份不同采收期广陈皮的代谢标志物，所述代谢标志物包括上述差异代谢标志物。本专利技术的目的之三在于提供上述代谢标志物在鉴别不同年份不同采收期广陈皮中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
本专利技术用于鉴别不同年份不同采收期广陈皮的标志代谢物能够清晰地揭示不同年份不同采收期广陈皮的差异,具有很好的区分不同年份不同采收期广陈皮的效果，为陈皮品质的鉴定和质量评价提供了一种优良的方法。
附图说明
图1、2为实施例1中不同年份不同采收期广陈皮混样质控QC的MRM色谱图，其中横坐标时间单位为min，混样质控QC的混合物为C1
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1、C1
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2、C2
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1、C2
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2、C3
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1、C3
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2提取物的等量混合物。图3为实施例1中不同年份不同采收期广陈皮PCA得分图。图4为实施例1中不同年份不同采收期广陈皮PCA 3D得分图。图5为实施例1中不同年份不同采收期广陈皮heatmap图。图6为实施例1中C3 vs C1代谢物含量差异动态分布图。图7为实施例1中C3 vs C1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于代谢组学鉴别不同年份不同采收期广陈皮的方法，其特征在于，(1)陈皮样品的制备；(2)陈皮样品的检测；(3)陈皮样品化学成分的鉴定；(4)代谢组学数据的处理与分析；所述陈皮样品的检测为色谱
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质谱检测，其中色谱条件为:1)色谱柱：Agilent SB
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C181.8μm，2.1mm*100mm；2)流动相：A相为超纯水，其中加入0.1％的甲酸，B相为乙腈，其中加入0.1％的甲酸；3)洗脱梯度：0.00min B相比例为5％，9.00min内B相比例线性增加到95％，并维持在95％1min，10.00
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11.10min，B相比例降为5％，并以5％平衡至14min；4)流速0.35mL/min；柱温40℃；进样量2μL；质谱条件为:电喷雾离子源温度500℃；离子喷雾电压IS 5500V正离子模式/
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4500V负离子模式；离子源气体I，气体II和气帘气分别设置为50、60和25psi，碰撞诱导电离参数设置为高，QQQ扫描使用MRM模式，并将碰撞气体氮气设置为中等，通过进一步的去簇电压和碰撞能优化，完成了各个MRM离子对的DP和CE，根据每个时期内洗脱的代谢物，在每个时期监测一组特定的MRM离子对。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，基于迈维代谢自建数据库MWDB(metware database)，根据二级谱信息进行物质定性，分析时去除了同位素信号，含K
+
离子、Na
+
离子、NH
4+
离子的重复信号，以及本身是其他更大分子量物质的碎片离子的重复信号。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，代谢物定量是利用三重四级杆质谱的多反应监测模式分析完成的，该模式中四级杆首先筛选目标物质的前体离子，排除掉其他分子量物质对应的离子以初步排除干扰；前体离子经碰撞室诱导电离后断裂形成很多碎片离子，碎片离子再通过三重四级杆过滤选择出所需要的一个特征碎片离子，排除非目标离子干扰，使定量更为精确，重复性更好，获得不同样本的代谢物质谱分析数据后，对所有物质色谱峰进行峰面积积分，并对其中同一代谢物在不同样本中的质谱出峰进行积分校正。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，代谢组学数据的处理与分析包括:将步骤(2)获得的不同年份不同采收期广陈皮的检测数据利用软件Analyst 1.6.3处理质谱数据，获得代谢物的保留时间和峰面积数据文件，处理后数据通过R软件进行多元统计分析：通过三重四级杆筛选出每个物质的特征离子，在检测器中获得特征离子的信号强度，利用Multia Quant软件打开样本下机质谱文件，进行色谱峰的积分和校正工作，每个色谱峰的峰面积代表对应物质的相对含量；基于步骤(3)鉴定的化学成分，获得能够区分不同年份不同采收期广陈皮的差异代谢标志物：C1
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1和C1
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2的差异代谢标志物包括橙皮素
‑7‑
O
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葡萄糖苷，柠檬素
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3,7
‑
O
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二葡萄糖苷，苜蓿素
‑5‑
O
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愈创木酚基甘油，山柰酚
‑3‑
O
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阿拉伯糖苷，柠檬素
‑3‑
O
‑
(羟基
‑3‑
甲基戊二酸)葡萄糖苷
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葡萄糖苷，3',5,5',7
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四羟基黄烷酮
‑7‑
O
‑
(6
”‑
没食子酰)
‑
β
‑
D
‑
葡萄糖苷，山柰酚
‑3‑
O
‑
(6
”‑
丙二酰)葡萄糖苷，金圣草黄素
‑6‑
C
‑
葡萄糖苷
‑
4'
‑
O
‑
(6
”‑
芥子酰)葡萄糖苷；C2
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1和C2
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2的差异代谢标志物包括3,5,7,4'
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四羟基
‑8‑
甲氧基黄酮
‑3‑
O
‑
葡萄糖苷
‑7‑
O
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鼠李糖苷，柚皮素
‑7‑
O
‑
(2
”‑
O
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芹糖基)葡萄糖苷，丁香亭
‑3‑
O
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芸香糖苷，柠檬素
‑3‑
O

【专利技术属性】
技术研发人员：梁社坚，赵岩伟，刘嘉慧，谢天啸，王静欣，张炯彬，廖晓鹏，胡晨晨，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：