一种检测依诺肝素钠肝素酶II酶解组分的方法技术

本发明专利技术提供了一种检测依诺肝素钠肝素酶II酶解组分的方法，属于肝素技术领域。所述方法包括如下步骤：1)将待检测肝素样品进行酶解，得到待检测肝素酶解液；2)采用液相色谱检测待检测肝素酶解液的组分含量；采用液相色谱进行检测时，使用流动相A和流动相B进行梯度洗脱；所述流动相A为116.88g/L的氯化钠水溶液；所述流动相B为5.844g/L的氯化钠水溶液；3)计算相对峰面积大于1％的组分含量。本发明专利技术提供的方法灵敏度高，分离度好，能够有效改善保留时间前移现象。时间前移现象。时间前移现象。

【技术实现步骤摘要】
一种检测依诺肝素钠肝素酶II酶解组分的方法


[0001]本专利技术属于肝素
，尤其涉及一种检测依诺肝素钠肝素酶II酶解组分的方法。

技术介绍

[0002]肝素在临床上作为一种抗凝、抗血栓药物使用。目前肝素是世界上最有效和临床用量最大的抗凝血药物，主要应用于心脑血管疾病和血液透析治疗，其中，其在血液透析治疗中是唯一有效的特效药物。依诺肝素钠是由肝素原料药作为原料进一步加工成的一大类抗血栓的药物，具有更为广泛的临床医学用，成为治疗急性静脉血栓和急性冠脉综合症(心绞痛、心肌梗塞)等疾病的首选药物，并且安全性更高，副作用更小。
[0003]依诺肝素钠肝素酶II酶解，肝素酶II有更广的特异性，能降解少量肝素和硫酸乙酰肝素的含2
‑
O
‑
硫酸化和2
‑
OH的糖醛酸糖苷键，为了解依诺肝素钠内部结构提供数据。但现有技术中采用液相色谱进行检测时，由于依诺肝素钠肝素酶II酶解产物分子量小，且成分多，分离度不好，且多次检测时保留时间会出现前移现象，影响检测灵敏度。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供了一种检测依诺肝素钠肝素酶II酶解组分的方法，灵敏度高，分离度好。
[0005]为了达到上述目的，本专利技术提供了一种检测依诺肝素钠肝素酶II酶解组分的方法，包括如下步骤：
[0006]1)将待检测肝素样品进行酶解，得到待检测肝素酶解液；
[0007]2)采用液相色谱检测待检测肝素酶解液的组分含量；
[0008]采用液相色谱进行检测时，使用流动相A和流动相B进行梯度洗脱；所述流动相A为116.88g/L的氯化钠水溶液；所述流动相B为5.844g/L的氯化钠水溶液；
[0009]3)计算相对峰面积大于1％的组分含量。
[0010]优选的，步骤2)中进行梯度洗脱时的过程如下：
[0011]时间/min流动相A/％流动相B/％00100100100253070404060606040701000751000760100850100
。
[0012]优选的，步骤2)中采用液相色谱进行检测时检测条件如下表所示：
[0013]柱箱温度30℃流速1.0mL/min运行时间85min进样体积50μL检测器UV检测器，232nm。
[0014]优选的，步骤2)中采用液相色谱进行检测时，分析柱为ProPac
TM
PA1 analytical column；保护柱为ProPac
TM
PA1 guard column。
[0015]优选的，步骤2)中采用液相色谱进行检测时采用硅胶化学键合强碱性季铵盐阴离子交换固定相为色谱柱填充剂。
[0016]优选的，步骤1)中所述酶解包括如下步骤：
[0017]将待检测肝素样品溶解，将得到的溶解液过滤，得到待酶解检测样品溶液；取待酶解检测样品溶液，用肝素酶Ⅱ溶液进行酶解，得到待检测肝素酶解液。
[0018]优选的，采用0.22μm滤膜进行过滤。
[0019]优选的，所述酶解温度为20～30℃，酶解时间为45～50h。
[0020]优选的，所述肝素酶Ⅱ的浓度为0.1～0.5IU/μL。
[0021]优选的，步骤3)中采用面积归一化法计算组分含量。
[0022]与现有技术相比，本专利技术的优点和积极效果在于：
[0023]1、本专利技术提供的方法检测灵敏度高，分离度好。
[0024]2、本专利技术提供的方法使色谱柱耐用性极好，每根色谱柱大约运行500针，是普通SAX柱的10倍左右。
[0025]3、本专利技术提供的方法色谱图重复性好，常规检测方法，色谱柱随检测数量的增加保留时间迁移，此方法的洗脱梯度及色谱柱有效改善保留时间前移现象。
[0026]4、本专利技术中所涉及的仪器设备均为常规仪器设备，使得本专利技术方法可广泛应用于企业、机构等日常检测。
[0027]5、本专利技术中检测方法易于学习、操作简便、容易分析，便于推广使用。
附图说明
[0028]图1为实施例1中的编号为1的依诺肝素钠肝素酶II酶解谱图；
[0029]图2为实施例1中的编号为2的依诺肝素钠肝素酶II酶解谱图；
[0030]图3为实施例1中的编号为3的依诺肝素钠肝素酶II酶解谱图；
[0031]图4为实施例1中多批次的依诺肝素钠肝素酶II酶解谱图；
[0032]图5为对比例1中的编号为1的依诺肝素钠肝素酶II酶解谱图；
[0033]图6为对比例1中的多批次的依诺肝素钠肝素酶II酶解谱图。
[0034]图7为对比例2中的依诺肝素钠肝素酶II酶解谱图。
[0035]图8为对比例3中的依诺肝素钠肝素酶II酶解谱图。
具体实施方式
[0036]下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0037]本专利技术提供了一种检测依诺肝素钠肝素酶II酶解组分的方法，包括如下步骤：
[0038]1)将待检测肝素样品进行酶解，得到待检测肝素酶解液；
[0039]2)采用液相色谱检测待检测肝素酶解液的组分含量；
[0040]采用液相色谱进行检测时，使用流动相A和流动相B进行梯度洗脱；所述流动相A为116.88g/L的氯化钠水溶液；所述流动相B为5.844g/L的氯化钠水溶液；
[0041]3)计算相对峰面积大于1％的组分含量。
[0042]本专利技术将待检测肝素样品进行酶解，得到待检测肝素酶解液。在本专利技术中，所述酶解优选包括如下步骤：
[0043]将待检测肝素样品溶解，将得到的溶解液过滤，得到待酶解检测样品溶液；
[0044]取待酶解检测样品溶液，用肝素酶Ⅱ溶液进行酶解，得到待检测肝素酶解液。
[0045]在本专利技术中，优选采用0.22μm滤膜进行过滤。在本专利技术中，进行酶解时，所述酶解的温度优选为20～30℃，更优选为25℃；所述酶解的时间优选为45～50h，更优选为48h。
[0046]在本专利技术中，所述肝素酶II优选为CAS NO：149371
‑
12
‑
0。
[0047]在本专利技术中，所述肝素酶Ⅱ的浓度优选为0.1～0.5IU/μL。
[0048]得到待检测肝素酶解液后，本专利技术采用液相色谱检测待检测肝素酶解液的组分含量；采用液相色谱进行检测时，使用流动相A和流动相B进行梯度洗脱；所述流动相A为116.88g/L的氯化钠水溶液；所述流动相B为5.844g/L的氯化钠水溶液。
[0049]本专利技术中，采用116.88g/L的氯化钠水溶液作为流动相A，5.844g/L的氯化钠水溶液作为流动相B，可以更好的保护液相系统，延长仪器使用寿命。采用该方式进行梯度本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测依诺肝素钠肝素酶II酶解组分的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)将待检测肝素样品进行酶解，得到待检测肝素酶解液；2)采用液相色谱检测待检测肝素酶解液的组分含量；采用液相色谱进行检测时，使用流动相A和流动相B进行梯度洗脱；所述流动相A为116.88g/L的氯化钠水溶液；所述流动相B为5.844g/L的氯化钠水溶液；3)计算相对峰面积大于1％的组分含量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中进行梯度洗脱时的过程如下：时间/min流动相A/％流动相B/％00100100100253070404060606040701000751000760100850100。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中采用液相色谱进行检测时检测条件如下表所示：。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中采用液相色谱进行检测时，分析柱为ProPac
TM
PA1 an...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵娟，董磊，李辉辉，艾自明，王秀萍，郭朝辉，郭晴怡，
申请(专利权)人：东营天东制药有限公司，
类型：发明
国别省市：