一种Fc融合纳米抗体CTLA-4Nb16-Fc及其制备方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种新型Fc融合纳米抗体CTLA

【技术实现步骤摘要】
IDNO.2所示；优选地，所述新型Fc融合蛋白纳米抗体的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。
[0006]本专利技术的新型Fc融合蛋白纳米抗体分子量小，穿透性强，抗原结合性能好且免疫原性弱，能够通过Fc段延长纳米抗体在体内的作用时间，保留了ADCC、ADCP和CDC等细胞毒性效应，并能有效阻断T细胞表面CTLA
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4分子，从而增强T细胞活化所需的信号；能够显著增强树突状细胞/肿瘤细胞融合疫苗诱导的特异性T淋巴细胞对靶细胞的杀伤能力，抑制肿瘤生长并延长荷瘤小鼠的生存时间。
[0007]本专利技术的第二方面，提供一种多核苷酸，其编码所述新型Fc融合蛋白纳米抗体CTLA
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4Nb16
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Fc；优选地，编码所述CTLA
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4Nb16
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Fc的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。
[0008]本专利技术的第三方面，提供一种表达载体，其含有所述多核苷酸。
[0009]本专利技术的第四方面，提供一种宿主细胞，其被所述表达载体所转化。
[0010]本专利技术的第五方面，提供一种药物组合物，其包含所述新型Fc融合纳米抗体CTLA
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4Nb16
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Fc和可药用载体。
[0011]本专利技术的第六方面，提供一种新型Fc融合蛋白纳米抗体CTLA
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4Nb16
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Fc的制备方法，包括构建含有新型Fc融合蛋白纳米抗体CTLA
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4Nb16
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Fc的基因序列的原核表达载体，然后将含有Fc融合蛋白纳米抗体CTLA
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4Nb16
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Fc的基因序列的原核表达载体转化至宿主菌中诱导表达和纯化，从而获得所述新型Fc融合蛋白纳米抗体CTLA
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4Nb16
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Fc，所述原核表达载体采用pET
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30a（+）。
[0012]所述宿主菌采用E.coliRosstta(DE3)。
[0013]本专利技术的第七方面，提供一种新型Fc融合蛋白纳米抗体CTLA
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4Nb16
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Fc在制备用于治疗肿瘤药物中的应用，包括采用基因工程技术，将高亲和力hCTLA
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4Nb16基因、hIgG1Fc片段基因通过柔性接头序列Ger4Ser相连，并插入用于纯化和鉴定的含标签蛋白基因His
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tag，进行基因重组克隆，得到CTLA
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4Nb16
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Fc重组基因序列的原核表达载体；然后将重组基因序列的原核表达载体转化至宿主菌中诱导表达，收获、溶解包涵体，用His标签蛋白试剂盒纯化，并进行超滤浓缩从而获得所述新型Fc融合纳米抗体CTLA
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4Nb16
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Fc；采用BCA法测定超滤浓缩后的CTLA
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4Nb16
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Fc（用ddH2O溶解）蛋白浓度，然后将CTLA
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4Nb16
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Fc融合蛋白联合树突状细胞/肿瘤细胞融合疫苗共同孵育的CD8
+
T细胞通过尾静脉注射，过继治疗荷瘤小鼠。观察小鼠皮下肿瘤的生长速度，计算荷瘤小鼠的生存时间，以此评判CTLA
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4Nb16
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Fc融合蛋白的治疗效果。具体步骤和产生的效果如下：（1）选取4
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6周龄BALB/c裸鼠,在右侧腋下皮下注射肿瘤细胞HepG2或者MCF7或者C8161100μL，含有2
×
107个细胞/mL，分别构建肝癌、乳腺癌和黑色素瘤三个肿瘤模型；观察肿瘤的成瘤情况，包括出瘤率、肿瘤体积和成瘤时间；（2）当小鼠瘤体积约为100mm3时开始治疗，当天记为“Day0”；选取出瘤情况一致，瘤体积大小相等的小鼠，将小鼠随机分为5组，每组5只；采取尾静脉注射给药，分别按照分组将药物用100μL重悬进行治疗，每周给药2次，连续2周；观察小鼠肿瘤的治疗效果；（3）在三种不同的荷瘤小鼠模型中，实验结果显示：CTLA
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4Nb16
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Fc联合树突状细胞/肿瘤细胞融合疫苗共同诱导的CTLs过继治疗能够显著抑制肿瘤生长和延长荷瘤小鼠生存时间。
有益效果
[0014]1.本专利技术所述的新型Fc融合蛋白纳米抗体CTLA
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4 Nb16
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Fc是以融合人 IgG1 Fc 片段，并以纳米抗体作为结构基础的T细胞激动剂，该融合蛋白体积小，抗原结合性能好，容易基因工程改造和实现大量生产，免疫原性弱；以及引入的Fc片段可以与FcRn结合，从而克服纳米抗体在体内半衰期短、组织滞留少、血浆清除率快的缺点。此外，Fc段可介导额外的ADCC、ADCP和CDC等细胞毒性效应，与CTLA
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4 Nb16融合后，解决了原本纳米抗体生物功能单一的问题。采用原核细胞表达系统生产，其程序较传统单克隆抗体简单，且蛋白产量高，使用方便，可工业化生产，具有良好的发展前景且适于推广使用。
[0015]2.本专利技术所述的新型Fc融合蛋白纳米抗体CTLA
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4 Nb16
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Fc可延长纳米抗体在体内的作用时间，保留了ADCC、ADCP和CDC等细胞毒性效应。同时，所述新型Fc融合蛋白纳米抗体（CTLA
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4 Nb16
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Fc）包含的抗CTLA
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4纳米抗体能有效阻断CTLA
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4介导的免疫抑制信号通路，消除其免疫抑制功能，诱导T细胞激动剂具有更高疗效，在肿瘤免疫治疗领域具有良好的临床应用前景。
附图说明
[0016]图1 CTLA
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4 Nb16
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Fc 的结构示意图。
[0017]图2 CTLA
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4 Nb16
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Fc的作用机制示意图。
[0018]图3A 为重组质粒pET
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30a（+）
‑ꢀ
CTLA
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4 Nb16
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Fc示意图（A）和琼脂糖凝胶电泳图（B），其中，M表示Marker 泳道；2表示CTLA
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4 Nb16
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Fc双酶切产物泳道。
[0019]图4 为CTLA
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4 Nb16
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Fc蛋白SDS
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PAGE分析图，其中M表示Marker泳道，1表示CTLA
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4 Nb16
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Fc蛋白泳道。
[0020]图5 为CTLA
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4 Nb16
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Fc蛋白Western blot分析图，其中M表示Marker泳道；1表示CTLA
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4 Nb16
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Fc蛋白泳道本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Fc融合纳米抗体CTLA
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4 Nb16
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Fc，其特征在于：结构包含能够延长血浆半衰期及介导ADCC、ADCP和CDC细胞毒性效应的Fc段的第一功能域，所述Fc的氨基酸序列为SEQ ID No.2，其GenBank的登录号为: AH007035.2；以及能够特异性结合并有效阻断T细胞表面CTLA
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4分子的第二功能域Nb16；所述第二功能域抗CTLA
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4的纳米抗体Nb16（全名为CTLA
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4 Nb16）的决定簇互补区CDR由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述CDR1为SEQ ID No.1中的第26
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35位氨基酸；CDR2为SEQ ID No.1中的第51
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59位氨基酸；CDR3为SEQ ID No.1中的第97
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106位氨基酸；所述第一功能域、第二功能域从N端到C端顺序连接；所述抗CTLA
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4 Nb16与所述Fc之间通过连接片段连接，所述连接片段为以GGGGS为单元的柔性连接片段。2. 一种多核苷酸，其编码如权利要求1所述的Fc融合纳米抗体CTLA
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4 Nb16
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Fc。3.一种表达载体pET
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30a（+），其含有如权利要求2所述的多核苷酸。4. 一种宿主细胞E.coli Rosstta (DE3)，其转化有如权利要求3所述的表达载体。5. 一种药物组合物，其包含如权利要求1所述的Fc融合纳...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘爱群，卢小玲，李婷婷，江梦捷，杨晓梅，
申请(专利权)人：广西医科大学附属肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：