一种靶向TRBV12的单链抗体、CAR、CAR-NK细胞及应用制造技术

本发明专利技术提供一种靶向TRBV12的单链抗体、CAR、CAR

【技术实现步骤摘要】
一种靶向TRBV12的单链抗体、CAR、CAR
‑
NK细胞及应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种基于靶向TRBV12的单链抗体的CAR
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NK细胞及其制备与应用。

技术介绍

[0002]T细胞恶性肿瘤是一组广泛存在的异质性疾病，每一种类型都表现为不同发育阶段功能失调的T细胞克隆性增生，通常预后较差。T细胞恶性肿瘤包括T细胞急性淋巴细胞白血病(T
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ALL)、皮肤和外周T细胞淋巴瘤(CTCL和PTCL)以及成人T细胞白血病(ATL)。T细胞恶性肿瘤进展很快，可以在短期内快速浸润到淋巴结、肝、脾、中枢神经系统等组织器官，目前缺乏有效的治疗方法。虽然免疫疗法通过使用单克隆抗体、检查点抑制剂、双特异性T细胞接合剂和嵌合抗原受体(CAR)T细胞在癌症的治疗中取得一定的疗效，但在T细胞疾病中仅观察到有限的反应。因此对于恶性T细胞肿瘤的治疗，是目前临床所面临的一大难题。
[0003]目前细胞疗法治疗T细胞恶性肿瘤主要面临两个方面的限制：第一，目前CAR
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T细胞治疗在复发/难治性B细胞恶性肿瘤取得很好的疗效，以广谱性靶点CD19 CAR
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T为典型代表，在血液瘤的治疗中取得了巨大成就。从临床数据来看患者对于正常B细胞的消耗具有良好的耐受性，被认为是可接受的副作用。然而，靶向广泛T细胞抗原虽然可以控制T细胞肿瘤，但伴随正常T细胞耗竭会导致严重的免疫功能破坏。目前少数研究以CD7或CD5作为T细胞恶性肿瘤的治疗靶点，由于CD7/CD5也表达于正常T细胞表面，而这种广泛靶向T细胞抗原引起了严重T细胞再生障碍和免疫功能损伤。因此不同于B细胞肿瘤，针对T细胞恶性肿瘤而言，寻求一种不依赖于广泛T细胞抗原而针对特定肿瘤细胞群的靶点，进而保留正常T细胞，避免严重免疫破坏成为治疗T细胞恶性肿瘤的一大难题。第二，随着CAR
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T在临床应用越来越广泛，也显现出一定弊端，其中最主要的就是细胞因子释放综合征和神经毒性，这也极大的影响了CAR
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T的治疗效果。此外自体细胞获取给临床应用CAR
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T细胞带来了挑战，一方面一些病人由于疾病影响无法获得足够的高质量T细胞；另一方面制备细胞需要一定的时间，使得一些病人无法及时得到治疗。因此选取一种低免疫源性，实现异体回输的免疫细胞疗法，替代传统的CAR
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T细胞成为亟待进一步的解决的关键科学问题。
[0004]αβT细胞受体(TCR)是一种跨膜异源二聚体，由α、β两条肽链组成，负责特异性识别与MHC(主要组织相容性复合体)结合的抗原肽，激活T细胞产生后续的免疫应答。TCR在正常T细胞和T细胞肿瘤上均有表达，TCRβ链(TRB)种系基因座由68个可变(V)基因片段，以及2个多样性(D)、13个连接(J)和2个恒定(C)基因片段组成。TCRβ链基于核苷酸序列相似性，可变基因(TRBV)片段被分为30个TRBV家族。在T细胞发育过程中，V、D、J基因片段经历重排，导致连续的VDJ转录本在每个T细胞表面表达1种独特的TCRβ链，占正常人外周血T细胞总数的1％至5％。而在T细胞恶性肿瘤中，T细胞发生克隆性恶性增生，仅表达一种TRBV，这为选择性清除恶性克隆性T细胞同时保留大部分正常T细胞提供了潜在机会。有研究利用动物模型证实，表达单个TRBV的T细胞缺失，不影响机体的正常免疫反应。因此本研究从T细胞恶性肿瘤的靶点选择问题出发，建立了抗TRBV12的嵌合抗原受体，可以选择性的杀死TRBV12(+)肿
瘤细胞，而保留其他TRBV12(
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)的正常T细胞。与针对广泛T细胞类抗原相比，避免了因治疗而导致的T细胞再生障碍，保留了机体正常的免疫功能。
[0005]NK细胞，即自然杀伤细胞，作为人体免疫系统的第一道防线，可以主动识别和杀伤入侵机体的病毒以及被病毒感染的细胞。与具有广泛克隆重排的TCRs库的T细胞相比，NK细胞激活或抑制信号由种系编码受体如NKG2D或KIR(Ig样受体)和CD94
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NKG2异源二聚体介导，除了使用颗粒酶和穿孔素的直接细胞毒性外，触发的NK细胞还可以通过刺激炎症细胞因子的产生导致靶细胞的破坏。与T细胞相比，TCR的缺失大大降低了GvHD的风险，从而允许使用同种异体CAR
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NK细胞进行回输。此外与CAR
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T细胞相比，CAR
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NK细胞诱导细胞因子释放综合征(CRS)可能性更低，具有更高安全性。其次与使用自体T细胞制备CAR
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T相比，同种异体CAR
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NK细胞不仅可以克服终产品恶性肿瘤细胞污染的风险，还可以降低自体产品制备所需的成本与时间，方便随时取用。

技术实现思路

[0006]基于上述背景存在的目前对T细胞恶性肿瘤尚无有效治疗手段的技术缺陷，本专利技术提供一种基于人源的靶向TRBV12的单链抗体，将该单链抗体作为抗原结合结构域构建嵌合抗原受体CAR，通过CAR
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NK细胞表达，可以有效清除TRBV12(+)T细胞恶性肿瘤。
[0007]本专利技术的第一个目的，提供一种靶向TRBV12的单链抗体，包括重链可变区和轻链可变区，其中，重链可变区包括CDR
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H1、CDR
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H2和CDR
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H3组成的三个互补决定区，轻链可变区包括CDR
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L1、CDR
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L2和CDR
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L3组成的三个互补决定区；CDR
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H1的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示、CDR
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H2的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示、CDR
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H3的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；CDR
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L1氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示、CDR
‑
L2的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示、CDR
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L3的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
[0008]SEQ ID NO:2:NFRMH；
[0009]SEQ ID NO:3:YISSGSSTIYYADTMKG；
[0010]SEQ ID NO:4:RGEGAMDY；
[0011]SEQ ID NO:5:RAGSSVNYIY；
[0012]SEQ ID NO:6:YTSNLAP；
[0013]SEQ ID NO:7:QRFTSSPFT；
[0014]进一步地，所述抗体的氨基酸全长序列如SEQ ID NO:1所示。
[0015]SEQ ID NO:1：
[0016]DVQLVESGGGLVQPKGSRKLSCAASGFTFSNFRMHWVRRAPGKGLEMVAYISSGSSTIYYADTMKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARRGE本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向TRBV12的单链抗体，其特征在于：包括重链可变区和轻链可变区，其中，重链可变区包括CDR
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H1、CDR
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H2和CDR
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H3组成的三个互补决定区，轻链可变区包括CDR
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L1、CDR
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L2和CDR
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L3组成的三个互补决定区；CDR
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H1的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示、CDR
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H2的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示、CDR
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H3的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；CDR
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L1氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示、CDR
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L2的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示、CDR
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L3的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。2.根据权利要求1所述的靶向TRBV12的单链抗体，其特征在于：所述抗体的氨基酸全长序列如SEQ ID NO:1所示。3.一种分离的核酸，其编码权利要求1
‑
2任一项所述的单链抗体。4.根据权利要求3所述的核酸，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。5.一种包含如权利要求3所述的分离的核酸的表达载体、或宿主细胞。6.一种包含权利要求1
‑
2任一项所述的单链抗体的嵌合抗原...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐振宇，何连君，
申请(专利权)人：皖南医学院第一附属医院皖南医学院弋矶山医院，
类型：发明
国别省市：