一种用于HPV病毒检测的原位杂交试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术公开了一种用于HPV病毒检测的原位杂交试剂盒及其使用方法，所述试剂盒中包含用于HPV病毒检测的原位杂交探针，所述用于HPV病毒检测的原位杂交探针的序列如SEQ ID No：1~No：20所示，可分别用于检测HPV病毒编码的E6/E7 mRNA分子。此外，所述原位杂交试剂盒还包含信号放大序列I、信号放大序列II和信号放大序列III。本发明专利技术公开的用于HPV病毒检测的原位杂交试剂盒具有检测灵敏度高的优点。交试剂盒具有检测灵敏度高的优点。交试剂盒具有检测灵敏度高的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种用于HPV病毒检测的原位杂交试剂盒及其使用方法


[0001]本专利技术涉及基因检测领域，具体涉及到一组用于HPV病毒检测的原位杂交探针及其联合使用试剂。
[0002]背景资料
[0003]HPV为闭环双链DNA病毒，其基因组长约8000bp，可分为3个功能区，分别是早期转录区(E区)、晚期转录区(L区)和非转录区(长控制区，LCR)。而HPV各型别之间的基因差异主要集中在E区和L区，因此，检测E区或L区可对HPV进行分型鉴别。进一步调研显示，E区中的E6/E7基因可编码致癌蛋白，并且在HPV感染人细胞后会大量表达。因此，HPV病毒编码的E6/E7 mRNA检测是临床确诊HPV病毒感染的标志。
[0004]研究指出，持续的高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染与宫颈上皮内瘤变和宫颈癌密切相关，超过99.17％的宫颈癌患者均可检出HPV感染。虽然80％的HPV感染者会在2年内自行消退，但长时间(5
‑
10年)的持续感染将极大增加宫颈癌的患病风险。统计数据表明，宫颈癌是当前女性发病率第2位的恶性肿瘤，仅次于乳腺癌，严重危害女性生殖健康。
[0005]目前已发现的HPV病毒高达200多种类型，但被国家药监局认定为高危型HPV的只有13种。其中，HPV 16和18的危害性最大，且在我国人群中的感染率最高，约占HPV感染总数的70％。因此，有必要将HPV 16/18感染与其他型别HPV感染相区分。
[0006]当前HPV 16/18型表达的E6/E7 mRNA的检测方法主要分为2种类型，分别是PCR
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荧光探针法和原位杂交探针法。其中，PCR
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荧光探针法的检测灵敏度较高，但是对操作人员、检测设备和场地的要求也最为严格，不易推广。相比而言，原位杂交探针法不涉及核酸提取和基因扩增，无需昂贵的检测设备和严格分区的检测场所，只需要一台普通的显微镜即可观察HPV病毒在肿瘤细胞中的感染状况。因此，原位杂交探针法检测HPV 16/18型感染在我国现有发展条件下，还无法被完全替代。但由于HPV 16/18型表达的E6/E7 mRNA水平低于原位杂交检测技术的检测限，传统的原位杂交探针基本不能检测到阳性信号，造成假阴性的检测结果。

技术实现思路

[0007]本专利技术的主要目的在于提供一组用于HPV病毒检测的原位杂交探针及其联合使用试剂，其能够同时检测HPV 16/18型表达的E6/E7 mRNA，为HPV患者的临床诊断、癌症预防和治疗提供有价值的参考信息。
[0008]为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0009]检测HPV 16型病毒编码的E6/E7 mRNA的原位杂交探针，其特征在于，所述探针为SEQ ID NO:1
‑
NO：10所示序列。
[0010]检测HPV 18型病毒编码的E6/E7 mRNA的原位杂交探针，其特征在于，所述探针为SEQ ID NO:11
‑
NO：20所示序列。
[0011]所述探针结构为“Ω”型，由底部“靶标结合区”、颈部“互补配对区”和顶部“信号放
大区”，共3个部分组成。
[0012]所述原位杂交探针在制备检测HPV病毒的产品中的应用。
[0013]一种用于HPV病毒检测的原位杂交试剂盒，所述试剂盒中包含：检测HPV 16型病毒编码的E6/E7 mRNA的原位杂交探针和/或检测HPV 18型病毒编码的E6/E7 mRNA的原位杂交探针，检测HPV 16型病毒编码的E6/E7 mRNA的原位杂交探针，为SEQ ID NO:1
‑
NO：10所示序列；检测HPV 18型病毒编码的E6/E7mRNA的原位杂交探针，为SEQ ID NO:11
‑
NO：20所示序列。
[0014]10组HPV 16原位杂交探针和10组HPV 18原位杂交探针同时进行检测。还包括：
[0015]信号放大序列I、信号放大序列II和信号放大序列III，分别为SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23所示序列。
[0016]信号放大序列III的5
’
端和3
’
端各修饰了一个地高辛。
[0017]所述试剂盒中还包括检测领域可接受的试剂，例如：封闭液、消化液、缓冲液、染色液等等。
[0018]采用所述试剂盒检测HPV病毒的方法，包括如下步骤：
[0019]S1.脱蜡：将新鲜的石蜡切片放入二甲苯脱蜡，去除多余液体后，放入无水乙醇中，然后空气干燥；
[0020]S2.封闭：向干燥后的切片滴加80
‑
100μL的5％过氧化氢封闭液，室温避光孵育10min后用纯水进行洗涤，然后75％、95％、100％乙醇溶液梯度脱水各2min，空气晾干；
[0021]S3.消化：向干燥后的切片滴加80
‑
100μL的100μg/mL胃蛋白酶消化液，37℃孵育5
‑
30min后用纯水进行洗涤，然后75％、95％、100％乙醇溶液梯度脱水各2min，空气晾干；
[0022]S4.杂交：向干燥后的切片滴加5
‑
10μL的1～2ng/μL探针杂交液，盖上硅化盖玻片，橡胶水泥封边，37℃杂交孵育2～4小时或过夜；
[0023]S5.洗涤：小心去除橡胶水泥，将切片放入PBS缓冲液中揭下盖玻片，然后浸泡清洗10min；
[0024]S6.信号放大I：向洗涤后的切片滴加50
‑
100μL的信号放大序列I，37℃孵育30min后放入PBS缓冲液中清洗3min；
[0025]S7.信号放大II：向洗涤后的切片滴加50
‑
100μL的信号放大序列II，37℃孵育5
‑
30min min后放入PBS缓冲液中清洗3min；
[0026]S8.信号放大III：向洗涤后的切片滴加50
‑
100μL的信号放大序列III，37℃孵育5
‑
30min min后放入PBS缓冲液中清洗3min；
[0027]S9.结合：向洗涤后的切片上滴加30
‑
50μL的HRP标记的Digoxin抗体，37℃孵育5
‑
30min min后放入PBS缓冲液中清洗3min；
[0028]S10.显色：向切片上滴加80
‑
100μL的新配制的DAB工作液，室温孵育5
‑
10min；S11.复染
‑
脱水
‑
封片：用纯化水清洗掉多余的DAB工作液，然后滴加10
‑
30μL的苏木素染色液，室温孵育10
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30s后75％、95％、100％乙醇溶液梯度脱水各2min，空气晾干，最后中性树胶封片；
[0029]S12.阅本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测HPV 16型病毒编码的E6/E7 mRNA的原位杂交探针，其特征在于，所述探针为SEQ ID NO:1
‑
NO：10所示序列。2.检测HPV 18型病毒编码的E6/E7 mRNA的原位杂交探针，其特征在于，所述探针为SEQ ID NO:11
‑
NO：20所示序列。3.根据权利要求1或2所述的原位杂交探针，其特征在于，所述探针结构为“Ω”型，由底部“靶标结合区”、颈部“互补配对区”和顶部“信号放大区”，共3个部分组成。4.权利要求1或2所述原位杂交探针在制备检测HPV病毒的产品中的应用。5.一种用于HPV病毒检测的原位杂交试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含：检测HPV 16型病毒编码的E6/E7 mRNA的原位杂交探针和/或检测HPV 18型病毒编码的E6/E7 mRNA的原位杂交探针，所述检测HPV 16型病毒编码的E6/E7 mRNA的原位杂交探针，为SEQ ID NO:1
‑
NO：10所示序列，所述检测HPV 18型病毒编码的E6/E7 mRNA的原位杂交探针，为SEQ ID NO:11
‑
NO：20所示序列。6.根据权利要求5所述用于HPV病毒检测的原位杂交试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括信号放大序列。7.根据权利要求6所述用于HPV病毒检测的原位杂交试剂盒，其特征在于，所述信号放大序列包括信号放大序列I、信号放大序列II和信号放大序列III，分别为SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23所示序列。8.根据权利要求6所述用于HPV病毒检测的原位杂交试剂盒，其特征在于，所述信号放大序列III的5
’
端和3
’
端各修饰了一个地高辛。9.采用权利要求5
‑
8中任意一项所述试剂盒检测HPV病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1. 脱蜡：将新鲜的石蜡切片放入二甲苯脱蜡，去除多余液体后，放入无水乙醇中，然后空气干燥；S2. 封闭：...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕萍，胡子健，
申请(专利权)人：卡秋江苏生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：