一种猪繁殖与呼吸综合征病毒的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及应用制造技术

本申请涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及应用；所述MNP标记位点为在PRRSV基因组上筛选的具有亚型特异性的、且在亚型内部具有多个核苷酸多态性的基因组区域；所述MNP标记位点包括MNP

【技术实现步骤摘要】
一种猪繁殖与呼吸综合征病毒的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及应用


[0001]本申请涉及生物
，尤其涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及应用。

技术介绍

[0002]猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)是秋冬季节最常见的引起猪繁殖障碍和呼吸道疾病的病原体，是一种RNA病原体，其具有传播快和变异快的特点，严重危害猪的健康和规模猪场的经济效益。PRRSV主要包括欧洲型和美洲型2个亚型。已有的针对引起猪病的病原体检测和分型方法包括基于抗原抗体反应的免疫学方法和基于荧光PCR的分子生物学方法。但这些方法一次只检测其一种亚型，且一种亚型只检测一个标记；PRRSV毒株的高变异也常导致现有检测体系检测失败，另外上述方法不能检测序列变异，因此存在检测效率低和准确性低的局限；而基于测序技术的方法，比如宏基因组测序技术，可以同时检测各种亚型和检测序列变异，但往往包括大量的宿主测序数据，在对病原体低浓度的样本进行检测时，需要超深度的测序，导致超高的难以接受的测序成本。已有的分型方法主要通过检测SNP标记进行亚型的区分，但SNP标记存在多态性低，分型错误率高和物种区分能力弱的局限。同时微生物为群体性生物，群体中个体的变异导致在一个标记位点会存在多个等位基因型且存在低频的基因型，而SNP标记是二态性标记，难以捕获群体生物普遍存在的多等位基因型，存在标记多态性低、检测方法准确性和灵敏度低的缺陷。
[0003]因此如何提供PRRSV高多态性的新型分子标记，以实现在一个反应中对两种亚型多个标记进行高效、准确和灵敏的检测，是目前亟需解决的技术问题。

技术实现思路

[0004]本申请提供了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及应用，以解决现有技术中难以在一个反应中对多种亚型进行高效、准确和灵敏的检测的技术问题。
[0005]第一方面，本申请提供了一种PRRSV的MNP标记位点，所述MNP标记位点为在PRRSV基因组上筛选的具有亚型特异性的、且在亚型内部具有多个核苷酸多态性的基因组区域；所述MNP标记位点包括MNP
‑
1至MNP
‑
5的5个标记位点的至少一个。
[0006]可选的，所述PRRSV包括欧洲型和美洲型中的至少一种。
[0007]第二方面，本申请提供了一种用于检测第一方面所述的MNP标记位点的多重PCR引物组合物，所述多重PCR引物组合物包括第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对、第五引物对中的至少一对；
[0008]所述第一引物对的上游引物如SEQ ID NO.1所示，所述第一引物对的下游引物如SEQ ID NO.2所示；
[0009]所述第二引物对的上游引物如SEQ ID NO.3所示，所述第二引物对的下游引物如
SEQ ID NO.4所示；
[0010]所述第三引物对的上游引物如SEQ ID NO.5所示，所述第三引物对的下游引物如SEQ ID NO.6所示；
[0011]所述第四引物对的上游引物如SEQ ID NO.7所示，所述第四引物对的下游引物如SEQ ID NO.8所示；
[0012]所述第五引物对的上游引物如SEQ ID NO.9所示，所述第五引物对的下游引物如SEQ ID NO.10所示。
[0013]第三方面，本申请提供了一种用于检测第一方面所述的MNP标记位点的试剂盒，所述试剂盒包括第二方面所述的多重PCR引物组合物。
[0014]可选的，所述试剂盒还包括多重PCR预混液。
[0015]第四方面，本申请提供了一种第一方面所述的MNP标记位点或第二方面所述的引物组合物或第三方面所述的试剂盒在鉴定PRRSV和制备PRRSV鉴定产品中的应用。
[0016]第五方面，本申请提供了一种第一方面所述的MNP标记位点或第二方面所述的引物组合物或第三方面所述的试剂盒在检测PRRSV毒株间遗传变异和溯源中的应用。
[0017]第六方面，本申请提供了一种第一方面所述的MNP标记位点或第二方面所述的引物组合物或第三方面所述的试剂盒在构建PRRSV数据库中的应用。
[0018]第七方面，本申请提供了一种第一方面所述的MNP标记位点或第二方面所述的引物组合物或第三方面所述的试剂盒在分型检测PRRSV中的应用。
[0019]本申请实施例提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点：
[0020]本申请实施例提供的一种PRRSV的MNP标记位点，通过对PRRSV的2种亚型不同来源的基因组序列进行分析，发现了5个MNP标记位点，并根据发现的MNP标记位点设计多重引物组合物，可以利用设计的多重引物组合物进行多重PCR扩增，并融合二代测序平台进行扩增产物的测序，不仅可以满足一次性对2种亚型PRRSV的高通量、高效率、高准确性和高灵敏度的检测，还能满足精细到亚型的检测需求，还能满足准确检测PRRSV毒株间和毒株内部遗传变异的需求，为对引起猪疾病的病原体的科学研究、科学监测和防治提供技术支撑。
附图说明
[0021]此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本申请的实施例，并与说明书一起用于解释本申请的原理。
[0022]为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0023]图1为本申请实施例提供的MNP标记多态性原理示意图；
[0024]图2为本申请实施例提供的PRRSV的MNP标记位点的筛选和引物设计流程图；
[0025]图3为本申请实施例提供的MNP标记位点的检测流程图。
具体实施方式
[0026]为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是
本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
[0027]除非另有特别说明，本申请中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
[0028]本申请实施例提供了一种PRRSV的MNP标记位点，所述MNP标记位点为在每种亚型PRRSV基因组上筛选的具有亚型特异性的、且在亚型内部具有多个核苷酸多态性的基因组区域；所述MNP标记位点包括MNP
‑
1至MNP
‑
5的5个标记位点中的至少一个。
[0029]在一些可选的实施方式中，所述PRRSV的病原体基因组包括PRRS欧洲型基因组和美洲型基因组中的至少一种。
[0030]本申请实施例中，限定病原体基因组的具体种类，包括了PRRSV常见的2种亚型，从本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV的MNP标记位点，其特征在于，所述MNP标记位点为在PRRSV基因组上筛选的具有亚型特异性的、且在亚型内部具有多个核苷酸多态性的基因组区域；所述MNP标记位点包括MNP
‑
1至MNP
‑
5的5个标记位点的至少一个。2.根据权利要求1所述的MNP标记位点，其特征在于，所述PRRSV的病原体基因组包括PRRSV欧洲型基因组和美洲型基因组的至少一种。3.一种用于检测如权利要求1或2所述的MNP标记位点的多重PCR引物组合物，其特征在于，所述多重PCR引物组合物包括第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对、第五引物对中的至少一对；所述第一引物对的上游引物如SEQ ID NO.1所示，所述第一引物对的下游引物如SEQ ID NO.2所示；所述第二引物对的上游引物如SEQ ID NO.3所示，所述第二引物对的下游引物如SEQ ID NO.4所示；所述第三引物对的上游引物如SEQ ID NO.5所示，所述第三引物对的下游引物如SEQ ID NO.6所示；所述第四引物对的上游引物如SEQ ID NO.7所示，所述第四引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：李论，高利芬，彭海，原霖，张淼洁，陈亚娜，方治伟，周俊飞，李甜甜，陈利红，肖华锋，宋会银，万人静，
申请(专利权)人：北京中科基因技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：