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【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因检测领域,具体涉及到一种辅助鉴别肺结节良恶性的甲基化检测试剂盒。
技术介绍
1、低剂量螺旋ct(ldct)是当前临床上最常用的肺癌筛查手段。对于ldct筛查发现的肺结节患者,当前临床上常用的非侵入性检测技术包括pet-ct、痰细胞学检查、血清学检查等。这些技术各有优劣,其中,pet-ct的检测灵敏度最高,但费用昂贵,且伴有大量辐射,一年只能做一次。痰细胞学检查的特异性最高,但十分依赖于病理医师的诊断经验,漏诊率极高。至于血清学检查,例如癌胚抗原(cea)、甲胎蛋白(afp)等,因为价格便宜,在医院被广泛应用,但检测灵敏度和特异性均不理想。因此,面对如今愈发严峻的癌症诊疗形势,许多专家学者都在呼吁开发新的检测指标。特别是对于癌症早筛,dna突变指标假阳性率高,dna甲基化最有前景。
2、dna是人类最早发现的一种表观遗传现象,通常发生在抑癌基因的启动子区。在正常细胞中,抑癌基因通常是非甲基化的或者低甲基化的。但在肿瘤细胞中,抑癌基因通常是高甲基化的。这也就意味着,在正常细胞向肿瘤细胞转变的过程中,伴随着抑癌基因逐步甲基化的发生。因此,基于dna的甲基化检测,可以用于癌症患者的辅助诊断。
3、因此,针对肺癌患者的早期筛查,最需要解决的关键点是提高基因甲基化检测的灵敏度,尽早从ldct发现的疑似恶性肺结节(早期肺癌)患者中筛选出存在基因异常甲基化的人群进行手术。
4、其次,与传统病原微生物的pcr检测不同,甲基化检测不仅要将样本中的dna提取出来,还要将dna中非甲基化的胞嘧啶转化
5、因此,优化甲基化检测样本的前处理流程,尤其是亚硫酸氢盐转化,也是一个需要解决的关键点。
技术实现思路
1、为了解决现有肺癌基因甲基化检测技术所存在的问题,本专利技术公开了一种辅助鉴别肺结节良恶性的甲基化检测试剂盒,通过摸索转化试剂的配方,优化甲基化检测样本的前处理流程,筛选肺癌相关甲基化基因,调整阳性判断方式等途径,实现将ct扫描发现的需要进行手术的疑似恶性肺结节(早期肺癌)患者分为甲基化阳性和甲基化阴性两类;经临床试验验证,甲基化阳性组中疑似恶性肺结节患者的恶性概率为甲基化阴性组的2-3倍;避免肺癌患者错过早期发现的良好机会,减少良性病人接受不必要的手术,影响未来的生活质量。
2、具体来说,本专利技术涉及以下内容:
3、 一种辅助鉴别肺结节良恶性的甲基化检测试剂盒,包括检测shox2、sct、hoxa7基因的引物探针组,其序列如seq id no:1-9所示。
4、优选地,甲基化检测试剂盒中还包含检测人内参基因18s的引物探针组,为seq idno:10-12所示序列。
5、上述引物及探针的核苷酸序列如表1所示:
6、 表1. 引物和探针序列表
7、
8、一种辅助鉴别肺结节良恶性的甲基化检测试剂盒,包括以下组成部分:
9、 (1)阴性质控品:人血细胞基因组dna的胎牛血清溶液;
10、 (2)阳性质控品:肺癌细胞基因组dna的胎牛血清溶液。
11、优选地,人血细胞为人外周血单个核细胞(pbmc),肺癌细胞为人肺腺癌细胞(a549)。
12、更优选地,阴性质控品和阳性质控品中dna的浓度均优选为25 ng/ml。
13、一种辅助鉴别肺结节良恶性的甲基化检测试剂盒,还包括:亚硫酸氢盐转化试剂,亚硫酸氢盐转化试剂为亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、甲酰胺和水的混合溶液,亚硫酸氢钠的浓度为2 mol/l,亚硫酸钠的浓度为0.15 mol/l,甲酰胺的体积分数为3%,亚硫酸氢盐转化试剂的ph为5.4。
14、亚硫酸氢盐转化试剂的使用方法如下:
15、(1)样品准备:收集ldct发现的疑似恶性肺结节患者(早期肺癌)的外周血液样品,并通过羟基纳米磁珠吸附游离dna,无需进行纯化;
16、 (2)dna洗脱转化:使用亚硫酸氢盐转化试剂直接将磁珠上吸附的游离dna洗脱下来,进行亚硫酸氢盐转化,无需额外添加其他任何试剂,转化反应程序优选为98℃高温解链5 min后,62℃孵育30 min;
17、 (3)通过硅胶膜离心柱回收纯化转化完成后的游离dna。
18、一种辅助鉴别肺结节良恶性的甲基化检测试剂盒,还包括以下特征:
19、同时完成人shox2基因、sct基因和hoxa7基因甲基化,以及人内参18s基因的3次pcr复孔检测。除18s基因外,任一复孔检测到pcr扩增信号,即代表该基因甲基化检出。任意1个甲基化基因检出,即判断该样本为疑似,一段时间后复查。任意2个及以上甲基化基因检出,即判断该样本为阳性。无甲基化基因检出则判断为阴性。
20、有益效果
21、与现有技术相比,本专利技术至少具有如下的优点:
22、 (1)本专利技术的亚硫酸氢盐转化试剂中盐离子含量低,可直接洗脱磁珠上吸附的未纯化的dna,进行亚硫酸氢盐转化,无需额外添加其他任何试剂;将甲基化检测样本制备的流程由传统的4-6小时缩短到2-3小时,避免了dna在纯化过程中的损失;更重要的是亚硫酸氢盐转化试剂中包含dna变性剂,降低了转化反应温度,减少了dna在转化反应中的损失,将其回收率由以往的20%提升到40%;
23、 (2)本专利技术的阴性质控品为人血浆样品类似物,可以监测从样本前处理到pcr反应的全流程,而传统质控品只能监测pcr反应过程是否正常;并且,因为dna含量固定,经过dna提取、转化等前处理流程后,本专利技术阴性质控品pcr检测所得的ct值会在[23.00,26.00]的范围内,可用作室间质量评价的标准;
24、 (3)相比传统δct的判读方式,本专利技术检测试剂盒的判读方式更加清晰、直观,无需进行数学计算;而且传统判读方式要求3次pcr复孔检测中,2个复孔,甚至3个复孔检测到pcr扩增信号才代表该基因甲基化检出;但对pcr检测技术而言,只有待测核酸数量高于40拷贝时才能稳定检测到3个复孔检出;当待测核酸数量在20-40拷贝时,最有可能的情况就是3个复孔检测到2个复孔检出;当待测核酸数量低于20拷贝时,3个复孔中检测到1个复孔检出才是正常现象;而早期肺癌患者体内每毫升血浆中肿瘤dna的含量往往不到20拷贝;因此,本专利技术检测试剂盒的阳性判读标准更低,能够在ct扫描发现的疑似恶性肺结节(早期肺癌)患者基础上,尽可能筛选出其中存在基因异常甲基化的患者进行手术;临床试验数据显示,当前ct发现的疑似恶性肺结节(早期肺癌)患者最终确诊肺癌的比例为60%,而联合应用本专利技术检测试剂盒及其判读方式后,可将最终确诊肺癌的比例提高至80%,并减少40%的手术工作量。
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1.一种辅助鉴别肺结节良恶性的甲基化检测试剂盒,其特征在于,包含:检测基因SHOX2、SCT、HOXA7中任意一个或多个基因的引物和探针以及亚硫酸氢盐转化试剂;
2.根据权利要求1所述的一种辅助鉴别肺结节良恶性的甲基化检测试剂盒,其特征在于,还包含:
3.权利要求1所述的一种甲基化检测试剂盒的检测方法,其特征在于,包括如下步骤:
4.根据权利要求3所述的一种甲基化检测试剂盒的检测方法,其特征在于,亚硫酸氢盐转化试剂的转化方法如下:
【技术特征摘要】
1.一种辅助鉴别肺结节良恶性的甲基化检测试剂盒,其特征在于,包含:检测基因shox2、sct、hoxa7中任意一个或多个基因的引物和探针以及亚硫酸氢盐转化试剂;
2.根据权利要求1所述的一种辅助鉴别肺结节良恶性的甲基化检测试...
【专利技术属性】
技术研发人员:胡子健,吕萍,罗旭,
申请(专利权)人:卡秋江苏生物科技有限公司,
类型:发明
国别省市:
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