散装即食食品中致病菌荧光PCR检测体系及检测方法技术

本发明专利技术涉及生化检测领域，尤其是涉及一种用于散装即食食品中3种食源性致病菌多重荧光定量PCR检测体系、试剂盒及检测方法。本发明专利技术通过TaqMan探针法，建立散装即食食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的多重实时荧光定量PCR体系、试剂盒及检测方法，为散装即食食品中病原微生物的食品安全风险监测工作提供技术支持。提供技术支持。

【技术实现步骤摘要】
散装即食食品中致病菌荧光PCR检测体系及检测方法


[0001]本专利技术涉及生化检测领域，尤其是涉及一种用于散装即食食品中3种食源性致病菌多重荧光定量PCR检测体系、试剂盒及检测方法。
技术背景
[0002]超市、菜场等随处可见的酱腌菜、酱卤肉等散装即食食品虽食用便捷，但是从生产到餐桌中间设计多个环节，极易受到病原微生物的二次污染而引发食源性疾病，轻则呕吐腹泻，重则引起急性肠胃炎、败血症等疾病，严重危害人体健康。传统的国标法需要前增菌培养、选择性培养和生化试验三个步骤，是食源性致病菌检测的金标准，但是通常需要4～6天，不仅操作繁琐、耗时耗力，且灵敏度低，易造成错判漏检，难以满足食源性疾病时效性与准确性的要求，特别是在大批量的食品样本的检测过程中，这种缺点体现地更加明显。因此，开发一种简单、快速的食源性致病菌的检测方法尤为重要。

技术实现思路

[0003]本专利技术拟通过TaqMan探针法，建立散装即食食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的多重实时荧光定量PCR体系、试剂盒及检测方法，为散装即食食品中病原微生物的食品安全风险监测工作提供技术支持。
[0004]一种散装即食食品中致病菌荧光PCR检测体系包括非荧光扩增引物系统、检测探针系统以及荧光扩增引物系统；
[0005]其中，所述非荧光扩增引物系统包括：序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的沙门氏菌扩增引物对；序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的金黄色葡萄球菌扩增引物对；序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的蜡样芽孢杆菌扩增引物对；对应地，所述检测探针系统包括：序列如SEQ ID NO.7所示的沙门氏菌检测探针；序列如SEQ ID NO.8所示的金黄色葡萄球菌检测探针；序列如SEQ ID NO.9所示的蜡样芽孢杆菌检测探针；所述检测探针在5
’
端连接有第一荧光报告基团，在3
’
端连接有第一荧光淬灭基团，且不同检测探针的第一荧光报告基团不同。
[0006]在本专利技术的一些实施方式中，所述第一荧光报告基团选自FAM、VIC或CY5，所述第一荧光淬灭基团选自BHQ1、TAMRA或BHQ2。
[0007]在本专利技术的一些实施方式中，所述沙门氏菌检测探针连接的第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团分别为VIC和TAMRA。
[0008]在本专利技术的一些实施方式中，所述金黄色葡萄球菌检测探针连接的第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团分别为FAM和BHQ1。
[0009]在本专利技术的一些实施方式中，所述蜡样芽孢杆菌检测探针连接的第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团分别为CY5和BHQ2。
[0010]本专利技术还提供了一种用于联合检测散装即食食品中致病菌的试剂盒，其包括上述所述的散装即食食品中致病菌荧光PCR检测体系。
[0011]进一步地，一种用于联合检测散装即食食品中致病菌的试剂盒，其还包括DNA提取试剂、PCR反应缓冲液、Mg
2+
试剂、dNTPs以及Taq DNA聚合酶中的至少一种。
[0012]一种用于联合检测散装即食食品中致病菌的检测方法，其使用上述所述的散装即食食品中致病菌荧光PCR检测体系，所述检测方法包括以下步骤：提取待测样本的DNA；以提取的DNA作为模板，以所述非荧光扩增引物系统作为扩增引物，并加入检测探针系统进行实时荧光PCR扩增；在实时荧光PCR扩增过程中检测荧光信号，得到检测结果。
[0013]在本专利技术的一些实施方式中，一种用于联合检测散装即食食品中致病菌的检测方法，其最优反应体系为：总体积50μL，2
×
Probe qPCR Mix 25μL，3种菌混合上下游引物(10μmol/L)各1μL，混合探针(10μmol/L)各1μL，Rox reference DyeⅡ0.25μL,混合DNA模板3μL，dH2O补足至50μL；
[0014]在本专利技术的一些实施方式中，一种用于联合检测散装即食食品中致病菌的检测方法，所述扩增条件为：95℃预变性3min，94℃变性5s，60℃退火延伸30s，40个循环，在每个循环退火延伸阶段收集荧光信号,有明显S型扩增曲线且Ct值<35判定为阳性。
[0015]本专利技术在建立同时检测散装即食食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的多重实时荧光PCR方法，这比单重的更加复杂，不仅要避免多对引物探针之间的相互干扰和各目的片段之间的非特异性扩增，还要保证多对引物探针有相近的退火温度，保持相近的增效率,本专利技术选取发射波长相差较大的FAM、CY5荧光基团，且非荧光物质的BHQ系列作为猝灭基团来建立多重荧光定量PCR方法，结果可使3株目标菌均呈良好S型扩增曲线，且7株非目标菌均无特异性扩增。此外，该方法还具有较高的灵敏度和重复性。
[0016]为验证所建立的多重实时荧光PCR法在实际样品检测中的可行性，本专利技术应用已建立的方法对100份散装即食食品样本进行3种致病菌的检测，同时采用国标法进行对比验证。结果表明，多重荧光定量PCR法的阳性检出率略高于传统培养法，且检测时间大幅缩短，可更加快速、特异地实现对散装即食食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的检测。
[0017]本专利技术通过TaqMan探针法建立的散装即食食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的多重实时荧光定量PCR方法，将进一步完善优化，具有较广阔的应用前景，为食品检验检测工作的高效有序展开奠定良好基础，也可极大地确保食品质量，为食品安全做好预警工作，将更有力地为人民群众“舌尖上的安全”保驾护航。
附图说明
[0018]图1为实施例1中沙门氏菌单重实时荧光PCR检测图。
[0019]图2为实施例1中金黄色葡萄球菌单重实时荧光PCR检测图。
[0020]图3为实施例1中蜡样芽孢杆菌单重实时荧光PCR检测图。
[0021]图4为实施例2沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌多重实时荧光PCR检测图。
[0022]图5为实施例2沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌与对照组多重实时荧光PCR的特异性试验检测图。
具体实施方式
[0023]下列实施例用于进一步解释说明本专利技术，但是，它们并不构成对本专利技术范围的限制或限定。
[0024]本专利技术所用的实验菌株、材料试剂及仪器
[0025]实验菌株
[0026]实验所用标准菌株如下，其中目标菌株3株，为沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌；非目标菌株7株，均购买自标准菌株保藏中心，保藏于舟山市食品药品检验检测研究院内，详见表1。
[0027]表1实验菌株信息
[0028][0029][0030]材料与试剂
[0031]缓冲蛋白胨水(BPW)；亚希酸盐胱氨酸增菌液(SC)；四硫磺酸钠煌绿增菌液(TTB)基础；亚硫酸铋琼脂(BS)；木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂；Baird
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种散装即食食品中致病菌荧光PCR检测体系包括非荧光扩增引物系统、检测探针系统以及荧光扩增引物系统，其特征在于，所述非荧光扩增引物系统包括：序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的沙门氏菌扩增引物对；序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的金黄色葡萄球菌扩增引物对；序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的蜡样芽孢杆菌扩增引物对；对应地，所述检测探针系统包括：序列如SEQ ID NO.7所示的沙门氏菌检测探针；序列如SEQ ID NO.8所示的金黄色葡萄球菌检测探针；序列如SEQ ID NO.9所示的蜡样芽孢杆菌检测探针；所述检测探针在5
’
端连接有第一荧光报告基团，在3
’
端连接有第一荧光淬灭基团，且不同检测探针的第一荧光报告基团不同。2.根据权利要求1所述一种散装即食食品中致病菌荧光PCR检测体系，其特征在于所述第一荧光报告基团选自FAM、VIC或CY5，所述第一荧光淬灭基团选自BHQ1、TAMRA或BHQ2。3.根据权利要求1或2所述一种散装即食食品中致病菌荧光PCR检测体系，其特征在于所述沙门氏菌检测探针连接的第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团分别为VIC和TAMRA。4.根据权利要求1或2所述一种散装即食食品中致病菌荧光PCR检测体系，其特征在于所述金黄色葡萄球菌检测探针连接的第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团分别为FAM和BHQ1。5.根据权利要求1或2所述一种散装即食食品中致病菌荧光PCR检测体系，其特征在于所述蜡样芽孢杆菌检测探针连接的第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔洁，黄朱梁，
申请(专利权)人：舟山市食品药品检验检测研究院，
类型：发明
国别省市：