一种可同时检测多衣原体的多重PCR检测引物组合物及方法技术

本发明专利技术公开一种可同时检测多衣原体的多重PCR检测引物组合物及方法，包括：分别提取并制备鹦鹉热衣原体、猫衣原体和肺炎衣原体的DNA样品；根据DNA样品对鹦鹉热衣原体、猫衣原体和肺炎衣原体的基因进行同源性分析，设计与筛选每种衣原体的特异性引物，确保每对引物只能扩增出相应病原的序列片段；对特异性引物进行预设的PCR反应条件优化，以建立多重PCR反应体系。设计的3对引物，Tm值相近，保证了在相同退火温度下，鹦鹉热衣原体、猫衣原体和肺炎衣原体都能得到很好的扩增，实验的操作过程简单只需要加入Taq mix、上下游引物和DNA模板即可，结果观察简单，操作简便，能够一次性检查出多种病原混合感染的情况，降低漏诊几率。降低漏诊几率。降低漏诊几率。

【技术实现步骤摘要】
一种可同时检测多衣原体的多重PCR检测引物组合物及方法


[0001]本专利技术涉及防疫检测
，尤其涉及一种可同时检测多衣原体的多重PCR检测引物组合物及方法。

技术介绍

[0002]随着国内城市化进程的加快和生活水平的提高，宠物的饲养数量迅速增加，特别是犬、猫、鸟等。因此，与宠物的密切接触是人类可能感染衣原体的一个重要原因。动物衣原体病是由各类衣原体感染哺乳动物、禽类、节肢昆虫所发生的一类十分重要的人兽共患传染病。现有研究表明：宠物犬、猫和鸟以及人类均能感染鹦鹉热衣原体、猫衣原体和肺炎衣原体，犬主要感染鹦鹉热衣原体，也能感染猫衣原体，犬感染衣原体发病症状主要表现为结膜炎、角膜炎、脑炎和肺炎等；猫主要感染猫衣原体，也能感染鹦鹉热衣原体和肺炎衣原体，衣原体能通过空气或受感染猫的眼鼻分泌物传播，主要感染症状为肺炎、结膜炎和鼻炎，导致怀孕猫可能发生流产；宠物鸟特别是鹦鹉类鸟主要感染鹦鹉热衣原体，且可以通过吸入或密切接触导致人类患上鹦鹉热病。因此，人类在于宠物接触的过程中能够感染三种衣原体，从而引起结膜炎、呼吸道疾病、肺炎、肾小球炎、心内膜本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可同时检测多衣原体的多重PCR检测方法，其特征在于，包括：步骤S1：分别提取并制备鹦鹉热衣原体、猫衣原体和肺炎衣原体的DNA样品；步骤S2：根据所述DNA样品对鹦鹉热衣原体、猫衣原体和肺炎衣原体的基因进行同源性分析，设计与筛选每种衣原体的特异性引物，确保每对引物只能扩增出相应病原的序列片段，且引物之间互不干扰，不存在同源与互补；其中，所述特异性引物的序列如下：鹦鹉热衣原体OmpA基因的上下游引物分别为：CPSF:5
’‑
ATCTCTACCGATCTTCCAATGC
‑3’
(SEQ ID NO:1)；CPSR:5
’‑
TGTTGTTCCAGCCGTTATAGG
‑3’
(SEQ ID NO:2),片段282bp；猫衣原体OmpA基因的上下游引物分别为：CFEF:5
’‑
CCTTGTCGGATTGATTGGTCTT
‑3’
(SEQ ID NO:3)；CFER:5
’‑
GTTGAGCAATGCGGATAGTGT
‑3’
(SEQ ID NO:4),片段455bp；肺炎衣原体OmpA基因的上下游引物分别为：CPNF:5
’‑
ACTGCCGTAGATAGACCTAACC
‑3’
(SEQ ID NO:5)；CPNR:5
’‑
AACGAGATTGAACGCTGTAGAG
‑3’
(SEQ ID NO:6),片段171bp；步骤S3：对所述特异性引物进行预设的PCR反应条件优化，以建立多重PCR反应体系。2.如权利要求1所述的可同时检测多衣原体的多重PCR检测方法，其特征在于，所述步骤S3包括：选择20μL的PCR反应体系，该体系包含DNA混合模板2μL，上下游引物的浓度为10μmol/L，HighAffinityHotStartTaqmix3.8μL，ddH2O补平至20μL；根据多重条带的明暗度，相应的调整3对引物的比例；退火温度根据引物的Tm值范围
±
5℃进行设置，利用梯度PCR仪将退火温度设定为50.0℃
‑
60.0℃，同时在控制单一变量的情况下对循环次数进行优化，循环次数分别设置为30、35、40，最终确定最佳多重PCR反应体系及反应程序。3.如权利要求2所述的可同时检测多衣原体的多重PCR检测方法，其特征在于，所述步骤S3中，多重PCR反应条件为：在一个循环内，依次在95℃温度条件下维持5min，94℃温度条件下维持15s，55.6℃温度条件下维持20s，72℃温度条件下维持30s；在完成35个循环后，在72℃温度条件下维持1min。4.如权利要求1所述的可同时检测多衣原体的多重PCR检测方法，其特征在于，所述步骤S3之后还包括步骤S4...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴海冲，郑永慧，黄翠琴，郑智杰，梁孝本，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：