一种固定化双酶树脂及其制备方法与应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种固定化双酶树脂及其制备方法与应用。本发明专利技术的固定化双酶树脂简单、酶活回收率高达90％以上、蛋白回收效率达65％。多次使用后固定化双酶树脂的活力剩余高、转化率高，蛋白载量可达250mg/g，明显高于已有报道的通过包埋(20mg/g)等固定化方法的蛋白载量。本发明专利技术的固定化双酶树脂酶活高、循环稳定性高、有效提高辅酶的循环利用，具有机械强度高、生物相容性好、环境耐受性强、不易失活、稳定性高的优良特性。本发明专利技术的固定化双酶树脂用于催化制备(R)

【技术实现步骤摘要】
一种固定化双酶树脂及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于生物
，进一步涉及固定化酶
，具体涉及一种固定化双酶树脂及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]布瓦西坦(Brivaracetam)(化学名称为(2S)
‑2‑
[(4R)
‑2‑
氧代
‑4‑
丙基
‑1‑
吡咯烷基]丁酰胺)是左乙拉西坦的结构衍生物，为比利时优时比(UCB)最新开发的第三代抗癫痫药物。能与突触囊泡糖蛋白2a结合，亲和力较左乙拉西坦强15～30倍，更有效地降低部分性癫痫发作的频率。分别于2016年1月和2月被欧洲EMEA和美国FDA批准上市，用于治疗成人和16岁以上青少年癫痫患者的部分发作、伴有或不伴有继发全身发作的辅助治疗。
[0003]对布瓦西坦的合成方法已有较多研究，涉及化学法不对称合成、化学法手性拆分、酶法不对称合成和酶法手性拆分。由于布瓦西坦存在两个手性中心，化学合成法往往涉及复杂的对映体分离与纯化，成本较高；酶法手性拆分具备温和条件，降低手性化合物纯化成本，但其理论转化率只有50％。近几年，生物酶法的不对称合成技术不断地被开发应用，逐渐被应用到布瓦西坦中间体的合成中。
[0004]酶的固定化能促使酶与反应体系分离，实现酶的循环使用，同时增加了酶对环境的耐受性。现有的固定化酶方法可分为物理作用力固定和化学共价键结合固定等。依赖于物理作用力的固定化方式主要包括包埋、吸附、离子键合等，由于其不会破坏蛋白的三维结构，往往能获得较高的酶活回收率。但由于物理作用力相对较弱，不稳定，其固定的蛋白容易脱落，影响固定化酶的循环稳定性。而化学键共价连接主要包括载体与酶的共价连接和酶之间的共价交联等。与借助物理作用力的固定化方式不同，共价连接直接通过化学键共价的方法将酶与载体结合。因其共价键的相互作用较强，所制得的固定化酶的循环稳定性较好。但由于共价连接的氨基酸残基容易残留在酶的内部，同时其能够催化活性口袋，致使其对酶的结构和催化功能造成破坏，进一步导致酶活回收率偏低。

技术实现思路

[0005]本专利技术是为了克服现有技术中制备的固定化烯还原酶与醇脱氢酶的双酶体系酶活偏低、循环稳定性差、难以实现辅酶的循环利用、环境耐受性较差、催化效果差的缺陷，提供了一种固定化双酶树脂及其制备方法，并将其应用于不对称还原制备布瓦西坦中间体中。
[0006]为实现上述专利技术目的，本专利技术通过以下技术方案实现：一种固定化双酶树脂，包括树脂载体以及连接在所述树脂载体上的烯还原酶以及醇脱氢酶。
[0007]烯酮还原酶能够立体选择性不对称加氢被激活的C＝C，即由吸电子基团激活的C＝C，如α,β
‑
不饱和羰基化合物中的C＝C，一次加氢反应可引入两个潜在的手性中心，用于高效合成光学纯饱和氰化合物、光学纯硝基烷烃以及光学纯饱和醛或酮类化合物等。烯酮
还原酶是手性分子生物催化合成的重要酶类之一，该酶广泛存在于微生物中，尤其是细菌、真菌及植物中。烯酮还原酶催化反应过程是基于反式加氢的原则，同时在还原型辅酶Ⅰ(NADH)或者还原型辅酶Ⅱ(NADPH)当作辅酶的条件下，不对称加氢C＝C，产生辅酶因子NAD(P)
+
。为了使加氢反应不断进行，需要对这种辅酶因子进行再生反应，通常利用醇脱氢酶、甲醛脱氢酶或葡萄糖脱氢酶等脱氢酶类作为辅助催化剂，利用相对应的醇、甲酸或葡萄糖等廉价底物来实现辅酶因子的再生。因此，烯酮还原酶被用于生物催化过程，通常还需要辅酶再生系统的辅助，也即需要构筑双酶系统。有鉴于此，以简单方便且易于操作的方式建立双酶固定化方法，同时实现高酶活回收率和高循环稳定性，具有一定的应用价值。
[0008]此外，氧化还原酶的固定化过程中，常常由于其多聚体酶结构和辅基结构，其固定化过程中往往伴随着较高酶活的损失。除了通常的酶三级结构扭曲和化学失活的原因外，多聚体酶的单亚基解离和辅酶因子的解离也可能是重要的影响因素。因此，本专利技术人经多次实验后开发出一种基于烯酮还原酶和辅酶循环系统的双酶固定化方法，从而制备出一种能够保持高的酶活和循环稳定性的固定化双酶树脂。该固定化双酶树脂包括树脂载体以及连接在树脂载体上的烯还原酶以及醇脱氢酶。
[0009]作为优选，所述树脂载体为环氧树脂、伯氨基树脂中的任意一种或两种的组合。
[0010]环氧树脂的化学稳定性和机械强度较高，其作为树脂载体有助于在化学反应过程中提高反应的稳定性和转化率。伯氨基树脂是一种含有氨基官能团的聚合物，具有活性表面和极好的吸附能力，其表面的氨基官能团有助于促进烯还原酶以及醇脱氢酶中多肽链的生长。此外，伯氨基树脂表面的氨基官能团具有亲水性，能够吸附类似于酸、离子等杂质，从而有效提高反应产物的纯度。
[0011]作为优选，所述环氧树脂中包含有如下式(1)、式(2)中的任意一种或两种的组合的环氧官能团：
[0012]作为优选，所述环氧树脂为LX
‑
1000EP环氧树脂、LX
‑
1000EPA环氧树脂、LX
‑
103B环氧树脂、ES
‑
103B环氧树脂、ES
‑
109环氧树脂中的任意一种或多种的组合。
[0013]一种制备如上所述的固定化双酶树脂的方法，包括以下步骤：(S.1)发酵制备烯还原酶发酵液和醇脱氢酶发酵液并混合均匀得到混合发酵双酶液；(S.2)将步骤(S.1)中得到的混合发酵双酶液破碎、重悬、离心后得到包含有烯还原酶和醇脱氢酶的双酶粗酶混合液；(S.3)将树脂载体加入步骤(S.2)中得到的双酶粗酶混合液中，使得树脂载体与烯还原酶和醇脱氢酶交联反应，得到固定化双酶树脂。
[0014]作为进一步优选，所述步骤(S.1)中产烯还原酶发酵液的菌体与产醇脱氢酶发酵液的菌体浓度比为1:1～10:1，按菌体浓度比混合两种发酵液后进行离心，弃去上层清液并收集细胞，得到混合发酵双酶液。
[0015]作为进一步优选，所述步骤(S.2)得到双酶粗酶混合液的具体步骤如下：向步骤(S.1)中得到的混合发酵双酶液中加入缓冲液并震荡至混合均匀，得到细胞悬浊液；使用高压均质机将重悬后的细胞悬浊液破碎，得到细胞破碎液并进行离心，去除沉淀并收集上层清液，得到包含有烯还原酶和醇脱氢酶的双酶粗酶混合液。
[0016]作为更进一步优选，所述缓冲液为磷酸缓冲液，较佳地为20～2000mmol/L的磷酸缓冲液；更佳地为50～500mmol/L的磷酸盐缓冲液；进一步更佳地为100mmol/L的磷酸盐缓冲液。所述的磷酸缓冲液优选磷酸氢二钠
‑
磷酸二氢钠缓冲液。所述的磷酸缓冲液的pH较佳地为6～9，更佳地为7～8。
[0017]作为更进一步优选，磷酸盐缓冲液中需添加金属离子，优选镁离子，镁离子的浓度较佳地为1～100mmol/L，更佳地为1～10mmol/L，所述添加的镁离子优选氯化镁。
[0018]作为进一步优选，所述步骤(S.3)中得到固定化双酶树脂的具体步骤如本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种固定化双酶树脂，其特征在于，包括树脂载体以及连接在所述树脂载体上的烯还原酶以及醇脱氢酶。2.根据权利要求1所述的一种固定化双酶树脂，其特征在于，所述树脂载体为环氧树脂、伯氨基树脂中的任意一种或两种的组合。3.根据权利要求2所述的一种固定化双酶树脂，其特征在于，所述环氧树脂中包含有如下式(1)、式(2)中的任意一种或两种的组合的环氧官能团：4.根据权利要求2或3所述的一种固定化双酶树脂，其特征在于，所述环氧树脂为LX
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1000EP环氧树脂、LX
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1000EPA环氧树脂、LX
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103B环氧树脂、ES
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103B环氧树脂、ES
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109环氧树脂中的任意一种或多种的组合。5.一种制备如权利要求1～4中任意一项所述的固定化双酶树脂的方法，其特征在于，包括以下步骤：(S.1)发酵制备烯还原酶发酵液和醇脱氢酶发酵液并混合均匀得到混合发酵双酶液；(S.2)将步骤(S.1)中得到的混合发酵双酶液破碎、重悬、离心后得到包含有烯还原酶和醇脱氢酶的双酶粗酶混合液；(S.3)将树脂载体加入步骤(S.2)中得到的双酶粗酶混合液中，使得树脂载体与烯还原酶和醇脱氢酶交联反应，得到固定化双酶树脂。6.根据权利要求5所述的一种制备固定化双酶树脂的方法，其特征在于，所述步骤(S.3)中双酶粗酶混合液中含有的烯还原酶与树脂载体的相对用量为1
×
10
‑5～1
×
10
‑2U/g，双酶粗酶混合液中含有的醇脱氢酶与树脂载体的相对用量为10～1000U/g；所述步骤(S.3)中反应时间为1～24h，反应温度为10～40℃。7.一种如权利要求1～4中任意一项所...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈小龙，朱林江，卢昶鑫，陈翰驰，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：