一种蛋白材料固定L-TA与L-TAAAS的制备方法与其在产去甲肾上腺素上的应用技术

本发明专利技术公开一种蛋白材料固定L

【技术实现步骤摘要】
一种蛋白材料固定L
‑
TA与L
‑
TAAAS的制备方法与其在产去甲肾上腺素上的应用


[0001]本专利技术属于固定化酶
，具体涉及一种蛋白材料固定L
‑
TA与L
‑
TAAAS的制备方法与其在产去甲肾上腺素上的应用。

技术介绍

[0002]去甲肾上腺素是抗感染性休克的首选药物，用于改善组织灌注与氧输送，降低血乳酸水平，在感染休克治疗期间，NE同样通过以上方式在改善脑功能方面发挥独特作用和优势。
[0003]目前传统的体外制备去甲肾上腺素的方法均为化学合成法。主要是以氯乙酰儿茶酚为起始原料，经过氨化、催化氢化及L
‑
酒石酸拆分成功合成(
‑
)
‑
重酒石酸去甲肾上腺素。或者是以章鱼胺盐酸盐为原料，经氨基保护，氧化和脱保护合成了(
±
)
‑
去甲肾上腺素盐酸盐。合成路线通常较长，对设备和生产环境的要求也较高。生物合成法往往具有绿色、环保、安全、条件温和等优点，且有望克服传统化学制备过程中的诸多缺点。但是由于游离酶的重复利用性差，稳定性不好等特性，使其无法有效的利用于工业生产中，固定化酶则可以有效克服其缺点。增强其稳定性与重复利用性，有利于工业化的连续生产。

技术实现思路

[0004]针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种蛋白材料固定L
‑
TA与L
‑
TAAAS的制备方法与其在产去甲肾上腺素上的应用。本专利技术以基于L
‑
苏氨酸醛缩酶和L
‑
芳香族氨基酸脱羧酶级联催化合成去甲肾上腺素的生物合成路线，以3,4
‑
二羟基苯甲醛和甘氨酸为出发底物，经L
‑
TAs催化发生羟醛缩合反应生成屈昔多巴，后者在L
‑
AAADs作用生成产物NE。
[0005]为解决现有技术问题，本专利技术采取的技术方案为：
[0006]一种蛋白材料固定L
‑
TA与L
‑
TAAAS的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0007]步骤1，室温下，取1mL 10
‑
100mg/mL的卵清蛋白溶液,50
‑
300rpm下加入5mL DMSO、最后加入50mmoL、浓度为50
‑
75mmol/L Tris
‑
HCl缓冲溶液补至11mL，形成白色沉淀后；提高转速至300
‑
600rpm反应30min得白色悬浊液，以4000
‑
8000rpm离心洗涤3次，每次洗涤10min，得非质子极性溶剂介导的纳米材料；
[0008]步骤2,将非质子极性溶剂介导的纳米材料加入同体积的水分散后，，加入L
‑
苏氨酸醛缩酶，且L
‑
苏氨酸醛缩酶的终浓度为1
‑
4g/L，25℃
‑
40℃下恒温搅拌12H转速300转，之后用PBS缓冲液洗涤3次，冷冻干燥到恒重，得固定化L
‑
苏氨酸脱羧酶；
[0009]步骤3，取20
‑
80μL 1mol/L二甲基咪唑，金属离子20
‑
80μL，L
‑
芳香族氨基酸脱羧酶，最后加入纯水至5ml，其中，L
‑
芳香族氨基酸脱羧酶的终浓度为1g/L
‑
4g/L将配好的反应体系放入磁力搅拌器，反应30min，离心洗涤，收集上清液进行蛋白检测，计算蛋白量和固载率，同时取最后一次离心的沉淀，冷冻干燥到恒重，获得沸石咪唑酯骨架结构材料包埋的固定化L
‑
芳香族氨基酸脱羧酶。
[0010]作为改进的是，步骤1中卵清蛋白溶液的浓度为60mg/mL，所述Tris
‑
HCl缓冲溶液浓度为50mmol/L。
[0011]作为改进的是，步骤3中固定L
‑
芳香族氨基酸脱羧酶时，二甲基咪唑的加入量为80μL，金属离子为Zn
2+
,加入量为40μL。
[0012]作为改进的是，L
‑
TA的固定化酶终浓度为2g/L，L
‑
芳香族氨基酸脱羧酶固定化酶终浓度为2g/L。
[0013]上述的沸石咪唑酯骨架结构材料包埋的固定化L
‑
芳香族氨基酸脱羧酶在生产去甲肾上腺素上的应用。
[0014]作为改进的是，生产去甲肾上腺素的反应体系的生产温度为20
‑
45℃。
[0015]作为改进的是，生产去甲肾上腺素的反应体系的生产温度为反应体系的生产温度为37℃。
[0016]有益效果：
[0017]与现有技术相比，本专利技术一种蛋白材料固定L
‑
TA与L
‑
TAAAS的制备方法及其产去甲肾上腺素的应用，相较于化学法其更为环保，简化了反应步骤，相较于传统生物法，克服了游离酶的缺点，更适合产业化。两种固定化酶载体制备工艺简单，成本低廉，反应过程基本仅需要简单搅拌，反应物市面上均可买到且价格低廉；
[0018](1)克服游离酶易失活，难以重复利用的缺点；
[0019](2)克服了化学法污染环境步骤繁琐的缺点；
[0020](3)制备过程中不会产生有毒有害的副产物，制备过程对环境友好。
附图说明
[0021]图1为使用不同材料固定化L
‑
TA的活性；
[0022]图2为使用不同材料固定化L
‑
芳香族氨基酸脱羧酶的活性；
[0023]图3为二甲基咪唑与金属离子的体积比对沸石咪唑酯骨架结构材料包埋的固定化L
‑
芳香族氨基酸脱羧酶的活性影响；
[0024]图4为不同温度下沸石咪唑酯骨架结构材料包埋的固定化L
‑
芳香族氨基酸脱羧酶催化反应与游离酶(L
‑
芳香族氨基酸脱羧酶)催化反应的对比；(a)固定化酶，(b)游离酶；
[0025]图5为步骤1中非极性质子溶剂介导合成的蛋白材料的圆二色谱；
[0026]图6为步骤1中非极性质子溶剂介导合成的蛋白材料的水接触角与ZETA电位对比，(a)、(b)分别为反应前后的水接触角变化，(c)、(d)为ZETA电位变化；
[0027]图7为本专利技术产去甲肾上谢素的原理图。
具体实施方式
[0028]除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本专利技术所述领域的常规技术人通常理解的相同含义。虽然本专利技术仅描述了优选的方法和材料，但是在本专利技术的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
[002本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种蛋白材料固定L
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TA与L
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TAAAS的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，室温下，取1 mL 10
‑
100 mg/mL的卵清蛋白溶液, 50
‑
300 rpm下加入5 mL DMSO、最后加入50 mmoL、浓度为50
‑
75 mmol/L Tris
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HCl缓冲溶液补至11 mL，形成白色沉淀后；提高转速至300
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600 rpm反应30 min得白色悬浊液，以4000
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8000 rpm离心洗涤3次，每次洗涤10min，得非质子极性溶剂介导的纳米材料；步骤2,将非质子极性溶剂介导的纳米材料加入同体积的水分散后，，加入L
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苏氨酸醛缩酶，且L
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苏氨酸醛缩酶的终浓度为1
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4 g/L，25 ℃
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40 ℃下恒温搅拌12 H转速300转，之后用PBS缓冲液洗涤3次，冷冻干燥到恒重，得固定化L
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苏氨酸脱羧酶；步骤3，取20
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80 μL 1 mol/L二甲基咪唑，金属离子20
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80μL，L
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芳香族氨基酸脱羧酶，最后加入纯水至5ml，其中，L
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芳香族氨基酸脱羧酶的终浓度为1 g/L
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4 g/L 将配好的反应体系放入磁力搅拌器，反应30...

【专利技术属性】
技术研发人员：李辉，杨继宇，胡鑫峰，侯晨馨，储艳，王艺潼，陈可泉，王昕，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：