一种检测BRCA1/2全外显子区域的试剂盒和基因文库的构建方法技术

本发明专利技术提出了一种检测BRCA1/2全外显子区域的试剂盒和基因文库的构建方法，所述试剂盒包括多重PCR反应液，所述多重PCR反应液包括Tris

【技术实现步骤摘要】
一种检测BRCA1/2全外显子区域的试剂盒和基因文库的构建方法


[0001]本专利技术涉及基因检测领域，尤其涉及一种检测BRCA1/2全外显子区域的试剂盒和基因文库的构建方法。

技术介绍

[0002]人类BRCA1、BRCA2基因分别是人类17号、13号染色体上的重要基因，其表达的蛋白在维持人类基因组稳定中发挥重要作用。但是BRCA1、BRCA2的基因突变与家族遗传性乳腺癌具有高度相关性。通过对BRCA1/2基因突变的检测，可以筛选出乳腺癌高危人群、明确家族中有无相关基因突变、评估易感人群乳腺癌发生概率。
[0003]BRCA1和BRCA2基因目前已报道的变异类型包括无义突变、移码突变、非移码插入、非移码缺失、错义突变、同义突变、剪接位点突变，以及大片段的缺失或重排等，涉及到近4000个变异位点，而且这些突变分散遍布于各个外显子，没有证据表明存在突变热点区域，只存在少数几个相对高频的变异位点。BRCA1包含24个外显子，编码区长度约6K；BRCA2包含27个外显子，编码区长度约11K。若用传统的Sanger测序、qPCR方法或MLPA等对BRCA1/2整个基因进行检测，都不能一次性检测BRCA1和BRCA2基因的所有变异类型，且需要耗费大量的时间并且价格不菲。相比之下，高通量测序技术
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二代测序技术以其更为高效快速且能一次性对BRCA1和BRCA2基因所有外显子及邻近上下游区域内的变异同时进行检测，以更高性价比的优势脱颖而出，成为BRCA1/2基因检测市场的主力军。除BRCA1/2基因编码区的变异外，内含子发生的一些变异亦可能会通过干扰RNA剪接等方式影响蛋白质功能，因此，BRCA1/2基因检测必须同时覆盖编码区和相邻边界区(以
±
20bp为佳)。
[0004]专利号为CN111269980A的专利技术专利公开了BRCA1/2突变检测组合物、试剂盒及文库构建方法，该方法PCR缓冲体系包括Pfx缓冲液、MgSO4、dNTP和Pfx DNA聚合酶，该反应体系扩增效率低，影响检测结果。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术提出了一种扩增效率高的检测BRCA1/2全外显子区域的试剂盒和基因文库的构建方法。
[0006]本专利技术的技术方案是这样实现的：本专利技术提供了一种检测BRCA1/2全外显子区域的试剂盒，包括多重PCR反应液，所述多重PCR反应液包括Tris
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HCl、MgCl2，DTT、rATP和PEG600。
[0007]在以上技术方案的基础上，优选的，所述多重PCR反应液包括100
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150mM Tris
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HCl、10
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30mM MgCl2，1
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5mM DTT，1
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3mM rATP、10％
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20％体积分数的PEG600，反应液的pH为7
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7.5。
[0008]在以上技术方案的基础上，优选的，所述试剂盒还包括引物组和DNA聚合酶。
[0009]在以上技术方案的基础上，优选的，所述引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO：1
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160
所示。
[0010]在以上技术方案的基础上，优选的，所述引物组还包括根据测序接头设计的接头引物对。
[0011]在以上技术方案的基础上，优选的，所述接头引物对为Illumina接头或MGI接头的引物对。
[0012]在以上技术方案的基础上，优选的，所述Illumina接头的引物对上游引物对为如SEQ ID NO：161所示的上游引物，如SEQ ID NO：162所示的下游引物。
[0013]在以上技术方案的基础上，优选的，所述MGI接头的引物对为如SEQ ID NO：163所示的上游引物，如SEQ ID NO：164所示的下游引物。
[0014]在以上技术方案的基础上，优选的，所述试剂盒还包括片段筛选试剂，所述试剂为磁珠。
[0015]另一方面，本专利技术提供了一种BRCA1/2基因文库的构建方法，包括如下步骤：
[0016]S1，使用引物组对样品中的BRCA1/2基因进行第一轮PCR扩增，得到扩增子；
[0017]S2，对扩增子进行磁珠纯化；
[0018]S3，使用多重PCR反应液对纯化后的扩增子进行第二轮PCR扩增；
[0019]S4，对第二轮PCR扩增的片段进行筛选。
[0020]本专利技术的一种检测BRCA1/2全外显子区域的试剂盒和基因文库的构建方法相对于现有技术具有以下有益效果：
[0021](1)本专利技术共设计80对引物，可通过多重PCR的方式进行两轮扩增，实现对BRCA1/2全外显子区域覆盖率99％。
[0022](2)DTT(二硫苏糖醇)在本体系中的作用是增加引物结合效率：DTT是二硫键的还原剂，还可以保持酶中
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SH的还原态。在PCR反应体系中加入DTT，可以打断二硫键，使染色体DNA结合的蛋白质从DNA上释放出来，导致更多的DNA与引物结合，提高扩增效率。
[0023](3)本专利技术针对BRCA1/2基因的全外显子序列
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20bp进行引物设计，最少仅需10ng受试者DNA即可实现对BRCA1/2覆盖率99.4％，且测序深度达300X，并且本专利技术设计了一个适用于多重PCR的反应体系中，体系中各对引物等浓度混合，每对引物对应的靶点都能获得足够的扩增量，形成一套完善的、适用于各种多重引物的扩增体系。
[0024](4)本专利技术设计的引物添加Illumina或MGI接头可以实现在不同测序仪上进行测序。本专利技术设计的多重PCR建库方法可以兼容10
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200ngDNA建库，文库质量高，满足测序要求。
附图说明
[0025]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0026]图1为本专利技术实施例1的Q
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sep质检文库片段图；
[0027]图2为本专利技术对比例的Q
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sep质检文库片段图。
具体实施方式
[0028]下面将结合本专利技术实施方式，对本专利技术实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本专利技术一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本专利技术中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本专利技术保护的范围。
[0029]实施例1
[0030]一、引物设计
[0031]1.引物合成引物合成均采用HPLC方法纯化，采用高效液相色谱的原理，对引物DNA进行纯化是一种非常有效的纯化方式，能达到很高的纯度和灵敏度本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测BRCA1/2全外显子区域的试剂盒，其特征在于：包括多重PCR反应液，所述多重PCR反应液包括Tris
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HCl、MgCl2、DTT、rATP和PEG600。2.如权利要求1所述的一种检测BRCA1/2全外显子区域的试剂盒，其特征在于：所述多重PCR反应液包括100
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150mMTris
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HCl、10
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30mMMgCl2、1
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5mMDTT、1
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3mMrATP、10％
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20％体积分数的PEG600，反应液的pH为7
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7.5。3.如权利要求1所述的一种检测BRCA1/2全外显子区域的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括引物组和DNA聚合酶。4.如权利要求3所述的一种检测BRCA1/2全外显子区域的试剂盒，其特征在于：所述引物组包括80对引物，核苷酸序列如SEQ ID NO：1
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160所示。5.如权利要求4所述的一种检测BRCA1/2全外显子区域的试剂盒，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：李新平，李泽卿，郑婷婷，
申请(专利权)人：武汉远赞吉诺百客医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：