靶向激活雌激素受体GPER在抗急性髓系白血病中的应用制造技术

本发明专利技术涉及靶向激活雌激素受体GPER在抗急性髓系白血病细胞方面的应用，属于生物医学研究技术领域。本发明专利技术要解决的技术问题是为治疗急性髓系白血病提供一种新的分子靶点。GPER在急性髓系白血病中的表达水平较健康人低；利用GPER特异性激动剂靶向激活GPER，能够有效地抑制白血病细胞的生长能力，并且抑制白血病细胞周期，使大部分细胞阻滞在G2期，促进细胞凋亡。新型雌激素膜受体GPER有望成为急性髓系白血病新的分子治疗靶点。血病新的分子治疗靶点。

【技术实现步骤摘要】
靶向激活雌激素受体GPER在抗急性髓系白血病中的应用


[0001]本专利技术属于生物医学研究
，具体涉及新型雌激素受体GPER激活在抗急性髓系白血病中的应用。

技术介绍

[0002]急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是一类造血细胞发生遗传学改变、进而衍生为高度异质性的血液系统恶性肿瘤，是成人急性白血病最常见的类型。众所周知，AML主要的治疗方法是干细胞移植和化疗干细胞移植治疗具有一定的限制性，标准化疗则是“7+3”方案，即采用7天阿糖胞苷联合3天柔红霉素等蒽环类药物进行化疗，但仍有40％的患者未达到完全缓解。因此，亟须进一步寻找用于治疗AML的特异性靶点及精准化疗药物。
[0003]随着人们对肿瘤生物学行为认识的不断深入，性别差异被报道与肿瘤的发生率和总体生存率密切相关。值得注意的是，雌激素是性别差异的重要影响因素，并且雌激素主要通过雌激素受体发挥作用。近年来，雌激素受体也成为研究的热点。其中，G蛋白偶联雌激素受体(G protein
‑
coupled estrogen receptor，GPER)是一种新型的雌激素膜受体，其介导的雌激素效应与经典的雌激素核受体(ERα，ERβ)介导的基因组效应截然不同，表现出“快速”、“非基因组”信号活化等特点。GPER激活常通过MAPK或PI3K信号通路调控肿瘤细胞的增殖、周期、凋亡等生物学行为。最新研究发现，GPER特异性激动剂G
‑
1靶向激活GPER从而抑制乳腺癌、结直肠癌、肝细胞癌和套细胞淋巴瘤等癌症的发生发展。然而，靶向激活GPER在急性髓系白血病进展中的作用还未见报道。

技术实现思路

[0004]1.本专利技术要解决的技术问题是为治疗急性髓系白血病提供一种新的策略，以解决
技术介绍
中所提出的问题。
[0005]2.为解决上述技术问题，本专利技术的实施例提供一种实验性验证靶向激活雌激素受体GPER在治疗急性髓系白血病方面的应用，其特征在于，包括以下步骤：(1)检测GPER在白血病中的表达情况：首先，利用Oncomine和Beat AML数据库分析白血病患者GPER的基因表达水平以及GPER在男性和女性患者中的表达是否存在差异；其次，利用实时荧光定量PCR(quantitative real time PCR，qRT
‑
PCR),蛋白质印迹法(Western Blotting)，免疫组化试验和免疫荧光试验检测白血病原代细胞和细胞系中GPER的表达水平和定位；最后，利用http://www.urogene.org/cgi
‑
bin/methprimer/methprimer.cgi网站和亚硫酸氢基因组DNA测序分析GPER的CpG岛上的甲基化位点,并用去甲基化药物5
‑
Aza处理后检测GPER的mRNA表达水平。(2)GPER特异性激动剂G
‑
1对白血病细胞增殖和周期的影响：首先采用GPER的特异性激动剂G
‑
1处理白血病细胞系、白血病原代细胞及健康人的外周血CD34+细胞，然后利用活细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit
‑
8，CCK
‑
8)、5
‑
乙炔基
‑2‑
脱氧尿苷(5
‑
ethynyl
‑2’‑
deoxyuridine，EdU)细胞增殖检测试剂盒和克隆形成试验检测白血病细胞增殖能力的改变。此外，采用不同浓度的G
‑
1处理白血病细胞24h，再利用流式细胞术(flow cytometry，FCM)观察细胞周期的改变；进一步利用Western Blotting检测细胞周期相关蛋白的改变。(3)GPER特异性激动剂G
‑
1对白血病细胞凋亡的影响：首先采用不同浓度的G
‑
1处理白血病细胞系、白血病原代细胞及健康人的外周血CD34+细胞24h，再利用流式细胞术(flow cytometry，FCM)观察细胞凋亡的改变；其次，利用Western Blotting检测细胞凋亡相关蛋白的改变以及线粒体部分细胞色素C的释放情况。(4)干扰或过表达GPER对G
‑
1抑制白血病细胞增殖和促凋亡的影响：首先，利用shRNA慢病毒载体在OCI
‑
AML2细胞系敲低GPER，然后用G
‑
1处理白血病细胞，利用CCK
‑
8检测细胞增殖，利用FCM检测细胞凋亡；并利用pcDNA3.1
‑
EGFP/HA
‑
GPER质粒在KG1a细胞系中过表达GPER，然后用G
‑
1处理白血病细胞，利用CCK
‑
8检测细胞增殖，利用FCM检测细胞凋亡。
[0006]3.与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：(1)本专利技术首次报道新型雌激素受体GPER在急性髓系白血病细胞系中低表达，且GPER低表达与DNA启动子区甲基化有关，提示我们雌激素受体GPER有望成为急性髓系白血病治疗新的分子靶点。(2)本专利技术首次报道靶向激活GPER能够通过增加白血病细胞G2/M期阻滞并促进凋亡进而抑制细胞系和原代细胞体外增殖能力，而对正常细胞无影响，揭示了雌激素受体GPER的特异性激动剂G
‑
1有望用于临床治疗急性髓系白血病。
附图说明
[0007]图1A、图1B分别显示为在Oncomine和Beat AML 2个独立数据库来源的白血病患者中GPER的表达情况。
[0008]图1C显示为在Beat AML数据库来源的白血病男性和女性患者中GPER的表达情况。
[0009]图1D、图1E、图1F分别显示为在白血病原代细胞中GPER基因和蛋白的表达情况。
[0010]图1G、图1H、图1I显示为在白血病细胞系中GPER基因和蛋白的表达情况及亚细胞定位。
[0011]图1J、图1K显示为GPER的CpG岛上的甲基化位点。
[0012]图1L显示为去甲基化药物5
‑
Aza处理对GPER的mRNA表达水平的影响。
[0013]图2A、2B显示为利用CCK
‑
8实验观察G
‑
1处理的白血病细胞系生长能力的改变。
[0014]图2C显示为利用CCK
‑
8实验观察G
‑
1处理的白血病原代细胞和健康人外周血CD34+细胞生长能力的改变。
[0015]图2D显示为利用EdU实验观察G
‑
1处理的白血病细胞系增殖能力的改变。
[0016]图2E显示为利用克隆形成实验观察G
‑
1处理的白血病细胞系增殖能力的改变。
[0017]图2F显示为利用FCM实验观察G
‑
1处理的白血病细胞系周期的改变。
[0018]图2G显示为利用蛋白质印迹法观察本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种实验性验证靶向激活雌激素受体GPER在抗急性髓系白血病方面的应用，其特征在于，包括以下步骤：(1)检测GPER在白血病中的表达情况：首先，利用Oncomine和Beat AML数据库分析白血病患者GPER的基因表达水平以及GPER在男性和女性患者中的表达是否存在差异；其次，利用实时荧光定量PCR(quantitative real time PCR，qRT
‑
PCR),蛋白质印迹法(Western Blotting)，免疫组化试验和免疫荧光试验检测白血病原代细胞和细胞系中GPER的表达水平和定位；最后，利用http://www.urogene.org/cgi
‑
bin/methprimer/methprimer.cgi网站和亚硫酸氢基因组DNA测序分析GPER的CpG岛上的甲基化位点,并用去甲基化药物5
‑
Aza处理后检测GPER的mRNA表达水平。(2)GPER特异性激动剂G
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1对白血病细胞增殖和周期的影响：首先采用GPER的特异性激动剂G
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1处理白血病细胞系、白血病原代细胞及健康人的外周血CD34+细胞，然后利用活细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit
‑
8，CCK
‑
8)、5
‑
乙炔基
‑2‑
脱氧尿苷(5
‑
ethynyl
‑2’‑
deoxyuridine，EdU)细胞增殖检测试剂盒和克隆形成试验检测白血病细胞增殖能力的改变。此外，采用不同浓度的G
‑
1处理白血病细胞24h，再利用流式细胞术(flow cytometry，FCM)观察细胞周期的改变；进一步利用Western Blotting检测细胞周期相关蛋白的改变。(3)GPER特异性激动剂G
‑
1对白血病细胞凋亡的影响：首先采用不同浓度的G
‑
1处理白血病细胞系、白血病原代细胞及健康人的外周血CD34+细胞24h，再利用流式细胞术(flow cytometry，FCM)观察细胞凋亡的改变；其次，利用Western Blotting检测细胞凋亡相关蛋白的改变以及线粒体部分细胞色素C的释放情况。(4)干扰或过表达GPER对G
‑
1抑制白血病细胞增殖和促凋亡的影响：首先，利用shRNA慢病毒载体在OCI
‑
AML2细胞系敲低GPER，然后用G
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1处理白血病细胞，利用CCK
‑
8检测细胞增殖，利用FCM检测细胞凋亡；并利用pcDNA3.1
‑
EGFP/HA
‑
GPER质粒在KG1a细胞系中过表达GPER，然后用G
‑
1处理白血病细胞，利用CCK
‑
8检测细胞增殖，利用FCM检测细胞凋亡。2.按照权利要求1所述的实验性验证靶向激活雌激素受体GPER在抗急性髓系白血病方面的应用，其特征在于，步骤(1)所述利用实时荧光定量PCR(quantitative real time PCR，qRT
‑
PCR)和蛋白质印迹法检测白血病细胞系中GPER表达水平的具体方法如下：qRT
‑
PCR检测基因表达水平(1)RNA提取：首先，收集对数生长期的细胞，用PBS洗涤2次，4，000rpm
×
3min离心；然后，弃上清，在细胞沉淀中加入1mL RNA提取试剂TRIzol，充分震荡混匀，冰上静置10min；随后，加入TRIzol 1/5体积的氯仿，上下颠倒混匀，冰上静置后以12，000g
×
15min的条件4℃离心；吸取上清液至干净无酶的EP管中，加入与氯仿等体积的异丙醇，上下混匀，冰上静置后以12，000g
×
10min的条件4℃离心；弃上清，加入1ml新配制的75％乙醇溶液，清洗沉淀，以13，000g
×
15min的条件4℃离心；弃上清，待乙醇完全挥发后，根据沉淀量加入适量RNase free双蒸水溶解；最后，测定RNA浓度及纯度。(2)逆转录：按表1
‑
1配制逆转录体系，并进行逆转录。表1
‑
1逆转录反应体系(20μL体系)试剂用量5
×
PrimeScript RT Master Mix4.0μLtotal RNA1.0μg
RNase Free ddH2Oup to 20.0μL反应条件：37℃
×
15min，85℃
×
5s，4℃冷却。(3)qRT
‑
PCR：实时荧光定量PCR反应体系见表1
‑
2。表1
‑
2 qRT
‑
PCR反应体系(10μL体系)试剂用量(μL)cDNA1.0TB Green
TM Premix Ex Taq
TM II5.0forward primer0.4reverse primer0.4ddH2O3.2反应条件：首先，95℃预变性30s；其次，95℃变性5s，58℃退火30s，72℃延伸20s，采集荧光，循环39次。融解曲线条件：(65℃
‑
95℃)每上升0.5℃采集1次荧光。以β
‑
actin为内参，相对定量值结果采用2
–
ΔΔCt
计算。各基因的引物由上海生工有限公司合成，序列见表1
‑
3。表1
‑
3 qRT
‑
PCR的引物序列蛋白质印迹法检测蛋白表达水平(1)蛋白质提取：收集对数生长期的细胞，用PBS洗涤2次，5，000rpm
×
4min；加入沉淀量2到3倍体积的含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，充分震荡混匀；冰上裂解细胞30min，每10min涡旋振荡一次，重复3次，13，000rpm
×
30min，4℃离心；吸取上清液至预冷的新EP管中，BCA法检测蛋白浓度，剩余蛋白样品加入上清液1/4体积的5
×
loading buffer，煮沸变性后于
‑
40℃保存。(2)SDS
‑
PAGE凝胶电泳：配制12％的分离胶并缓慢灌胶，在凝胶表层缓慢加适量无水乙醇，37℃静置30min；弃去无水乙醇，在完全凝固的分离胶上层灌入配好的5％的浓缩胶，并插上齿梳，37℃静置20min；小心拔出齿梳，加入1
×
SDS电泳缓冲液；向加样孔中加入50μg蛋白样品，同时在样本两侧孔中加入蛋白marker作为分子量参照；在玻璃板内灌满电泳缓冲液后，按照两步法电泳分离蛋白：第一步，电压80V，电流150mA，30min；第二步，电压120V，电流200mA，60
‑
70min。12％分离胶与5％浓缩胶的配方见表1
‑
4。表1
‑
4 12％分离胶与5％浓缩胶配方试剂12％分离胶(mL)5％浓缩胶(mL)ddH2O4.9003.40030％丙烯酰胺6.0000.8301.5M Tris
‑
HCl(pH＝8.8)3.800
‑‑‑
1.0M Tris
‑
HCl(pH＝6.8)
‑‑‑
0.63010％SDS0.1500.050
10％AP0.1500.050TEMED0.0060.005(3)转膜：首先根据待测蛋白分子量大小，裁剪合适大小的聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜并置于甲醇中浸泡30s，蒸馏水洗涤2min，然后将PVDF膜和滤纸片浸泡在预冷的湿转液中。切取适当凝胶并浸泡在预冷的湿转液中，最后由正极向负极方向依次放置海绵、滤纸、PVDF膜和凝胶。以220mA的恒流电泳转膜，转膜时间由蛋白分子量大小决定。(4)封闭：转膜结束后，将PVDF膜放入5％的蛋白封闭液中，室温封闭2h。(5)抗体孵育：首先，用TBST清洗膜上残留的封闭液；其次，用定性滤纸吸干膜上残留液体后，将膜置于蜡板上，加入按一定比例预先稀释好的一抗工作液，均匀覆盖PVDF膜，于4℃孵育过夜；回收一抗工作液后将PVDF膜放入TBST中洗涤3次，10min/次；最后，加入按一定比例预先稀释好的辣根过氧化物酶标记的二抗于PVDF膜上，室温孵育1.5h，TBST洗涤3次，10min/次。(6)显色及成像：暗室内，将PVDF膜放置于蜡板上，然后加入配置好的化学发光试剂(A液和B液等体积混合)覆盖PVDF膜，于成像系统中显示成像。3.按照权利要求1所述的实验性验证靶向激活雌激素受体GPER在抗急性髓系白血病方面的应用，其特征在于，步骤(1)所述的利用免疫组化试验检测白血病细胞系中GPER表达水平的具体方法如下：首先用PBS洗涤白血病原代细胞和健康人外周血CD34+细胞，并用甩片机以500g
...

【专利技术属性】
技术研发人员：张伶，陶永红，任俊，黄军鹏，彭美茜，敬一佩，肖巧玲，杨静，林灿，孙明会，雷力，
申请(专利权)人：重庆医科大学国际体外诊断研究院，
类型：发明
国别省市：