一种抗猪流感转移因子制造技术

本发明专利技术涉及一种抗猪流感病毒的转移因子的制备工艺。使用本发明专利技术的转移因子可以起到预防猪流感、保护正常机体细胞免受猪流感病毒侵害的作用，从而降低发病率。同时对于遭受到猪流感病毒感染的猪使用该转移因子进行治疗，可以有效改善临床症状，提高治愈率、降低死亡率。其制备工艺包括：制备病毒抗原、提取病毒抗原、病毒抗原免疫猪、从免疫猪的脾脏中提取抗猪流感病毒转移因子等步骤。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于兽药领域，具体地说，是涉及一种抗猪流感转移因子的制备工艺。
技术介绍
猪流感病毒(Swine influenza virus, SIV) 一年四季可感染不同日龄、性别和品 种的猪，引起猪流感。猪流感是一种急性、热性、高度接触性的呼吸道传染病。其临床上以突 发、高热、流泪、咳嗽、呼吸困难衰竭和死亡为特征。虽然SIV引起的死亡率很低，病猪也可 迅速康复，但会导致猪只增重受阻，肉料比降低，生产性能下降，对养猪业造成极大的危害。1918年美国首次报道了本病的发生，1930年Shope从患病猪中分离到该病毒。迄 今为止，欧、美、亚、非、澳等世界各大洲均有本病的发生和流行。SI能引起猪的高发病率 (几乎100% )和低病死率(病死率< )。此病的发生可使患病猪生产性能下降，推迟上 市；还可引起呼吸道细菌和病毒继发或混合感染，使疫情更为严重，造成猪只死亡。猪流感 除了经典的Hmi和H3N2亚型外，其它亚型的病毒在北美猪群中也有流行和爆发，并且H4N6 和Hmi的禽流感病毒突破了种间障碍，传染给了猪；而猪流感感染人并导致人死亡的报道 也时有发生。猪在禽-猪-人的流感种间传播过程中，起着中间宿主及多重宿主的作用。猪 是人源、禽源和猪源流感病毒的惟一共同易感宿主，它能将流感病毒传播给人或鸟类。通过 监测SI的动态变化可以预测人流感的发展趋势。因此，研究SI具有更加深远的公共卫生 学意义。由于本病的流行和危害日益严重，因此对SIV的研究已成为国内外兽医界、医学界 和微生物学界的热点之一。尽管目前已经有一些抗猪流感的药品或制剂，但是由于现有药品制剂的针对性不 强，疗效有限，而且，治疗性制剂多是在发病后才应用的，不能起预防作用。首先对于猪流感 的易感猪群，每年定期对猪接种疫苗也是控制猪流感的有效措施，美国和欧洲都有Hmi亚 型和H3N2亚型的商品疫苗；其次应增强营养或药物干预，提高自身免疫力；再者通过药物 提高机体抵抗力或调节免疫力也是一种预防猪流感的有效方法，转移因子可起到此作用。转移因子(TF，Transfer Factor)是T淋巴细胞释放的一种能够转移致敏信息的 低分子量多肽-核苷酸复合物，它能将供体的某种特定的细胞免疫功能特异地转移给受体 正常的淋巴细胞，参与机体的免疫反应，提高受体机体的细胞免疫功能，抵抗真菌、病毒等 非细菌性感染；同时促进B淋巴细胞的抗体分泌作用，能够诱导细胞释放干扰素和白介素， 从而增强受体的免疫功能。目前已报道的转移因子的提取方法有关于非特异性转移因子的制备方法也有关 于特异性转移因子的制备方法。例如，中国专利技术专利申请“制备转移因子的工艺方法-全 滤法”(专利申请号=200310118439. 6)则公开了采用压滤、超滤、纳滤几种方法连续过滤的 制备工艺。另一份中国专利技术专利申请“制备转移因子的工艺方法-加热法”(专利申请号 200410039444. 2)是由同一申请人在前一份申请的基础上加上加热处理的步骤，仍然是连 续采用多种过滤法的制备工艺。关于特异性转移因子的专利如“一种抗鸡新城疫病毒转移 因子的制备方法”(专利申请号=200810053541. 5)则公开了用鸡新城疫病毒免疫猪，用组织捣碎机、冻融、离心、超滤法的制备工艺。还有一份专利“抗流感病毒转移因子的制备”(专 利申请号200610035059. X)则公开了用流感疫苗免疫猪，组织捣碎机捣碎、低温冻融、离 心、中空纤维管超过滤的制备工艺。上述专利申请的内容是对破碎后的组织经冷冻离心后 直接进行过滤提取，组织捣碎机存在细胞破碎不完全的缺陷，有些工艺繁琐，时间较长，对 产物的活性损失也较大，因此得率很难提高。因此，为了在最大限度保持活性、提高得率的基础上提取转移因子，同时为了适用 于工业化生产的需求，需要一种简单、实用、经济、高效的转移因子的提取方法。因此，我们 采用高压均质机快速破碎细胞，能更有效的保持转移因子活性在破碎期间不降低。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，克服现有技术中存在的不足，提供一种天然高效 纯生物活性物质抗猪流感病毒转移因子的制备方法。本专利技术抗猪流感病毒转移因子的制备方法，按照以下步骤进行(1)制备病毒抗原将猪流感病毒接种于MDBK细胞，加入的胰蛋白酶，37°C培 养24 72h。消化细胞，-20°C反复冻融3次，超声波破壁，IOOOOrpm离心5min，弃去沉淀 收集上清液，甲醛灭活4°C，过滤除菌，分装，-70°C保存。(2)纯化病毒抗原新鲜收获的病毒液5000rpm离心30min后，上清经40000rpm 离心2h，病毒沉淀用TEN悬浮；病毒悬液再经蔗糖密度梯度(20%，30%，40%，50%， 60%)20000rpm离心2h，收集各区带；然后加入适量的TEN，经20000rpm离心lh，沉淀用TEN 溶解，即得到纯化的病毒。(3)病毒抗原免疫猪挑选健康免疫猪，将上述无菌收获的病毒液做1 10稀释， 气管接种，l.OmL/头。逐日观察猪只的食欲、精神等症状，并每日测其体温2次。采集攻毒 后4d、7d和14d试验猪的血清，以血凝法或ELISA法检测上述病毒的特异性抗体效价，出现 病毒特异性免疫效价后，宰杀猪，取脾脏于-20°C保存，备用。(4)从免疫猪中提取抗猪流感病毒转移因子①先用注射用水洗净用猪流感病毒抗原免疫过的猪脾脏，去其表面的筋膜、脂肪 和大的血管等组织，再用生理盐水冲洗；②将洗净的猪脾脏剪碎，加入1 2倍体积4°C预冷的IOMmol PBS缓冲液，用高压 勻质机进行细胞破碎，同时加入壳聚糖溶液作为絮凝剂，混勻后制成勻浆；③置-20°C冷冻和室温融化，反复冻融8次；④将步骤③中得到的勻浆液用HCl调pH5. 0 6. 0，然后在4°C，以6000rpm离心 20min,收集上清液，反复3次后，将上清置于透析袋中并将透析袋放入盛有无菌生理盐水 的容器内，置于0-4°C透析72h ；⑤用4% NaHCO3调整透析液pH值至中性，并加入0. 3%的氯仿作防腐剂；⑥将透析液用0. 2 μ m中空纤维柱微滤，滤出液再用截留分子量为6000道尔顿的 中空纤维柱超滤，收集滤出液；⑦在滤出液中加入浓度为1. 5%的硬脂酸锌的2ml稳定剂后，通过0. 22μπι微孔滤 膜除菌过滤，然后加入5ml甘油的耐热保护剂，4°C保存，直接分装，即得到转移因子溶液。本专利技术所述的抗猪流感病毒转移因子的制备工艺，具有以下优点(1)原材料来源容易，无污染，价廉等优点。猪脾脏和胸腺属于屠宰后猪的下脚料， 以前多是丢弃的废物。(2)本工艺采用先攻毒后提取的方法，攻毒猪后在抗体水平最高期宰杀，取脾脏、 胸腺等，最终得到特异性抗猪流感病毒转移因子。(3)在提取转移因子过程中用低温冻融处理，不使小分子物质活性丧失，并能够使 猪流感病毒转移因子得以充分的提取。(4)离心前调pH，使大部分蛋白絮凝，使得离心后的上清液的澄清度明显好于以 前不调PH的方法；而且有利后续的微滤、超滤等操作。(5)在勻浆液中加入壳聚糖也起到蛋白絮凝的作用，简化后面的离心处理。(6)本专利技术既可基于前期的常规病毒抗原免疫步骤，又可优选本专利技术的免疫步骤， 具有灵活高效的优点。(7)转移因子提取物经体外生物活性试验及药理、毒性试验等证明，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗猪流感病毒的转移因子，其制备方法包括：（１）先用注射用水洗净用猪流感病毒抗原免疫过的猪脾脏，去其表面的筋膜、脂肪和大的血管等组织，再用生理盐水冲洗；（２）将洗净的猪脾脏剪碎，加入１～２倍体积４℃预冷的１０Ｍｍｏｌ－ＰＢＳ缓冲液，用高压均质机进行细胞破碎，同时加入１％壳聚糖溶液作为絮凝剂，混匀后制成匀浆；（３）置－２０℃冷冻和室温融化，反复冻融８次；（４）将步骤（３）中得到的匀浆液用ＨＣｌ调ｐＨ５．０～６．０，４℃６０００ｒｐｍ离心２０ｍｉｎ，收集上清液，反复３次后，将上清置于透析袋中并将透析袋放入盛有无菌生理盐水的容器内，置于０－４℃透析７２ｈ；（５）用４％ＮａＨＣＯ↓［３］调整透析液ｐＨ值至中性，并加入０．３％的氯仿作防腐剂；（６）将透析液用０．２μｍ中空纤维柱微滤，滤出液再用截留分子量为６０００道尔顿的中空纤维柱超滤，收集滤出液；（７）在滤出液中加入浓度为１．５％的硬脂酸锌２ｍｌ稳定剂后，通过０．２２μｍ微孔滤膜除菌过滤，然后加入５ｍｌ甘油的耐热保护剂，４℃保存，直接分装，即得到转移因子溶液。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王小娥，
申请(专利权)人：天津瑞普生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]