一种基于肠道激素紊乱的小鼠肠内分泌细胞类器官模型的构建方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种基于肠道激素紊乱的小鼠肠内分泌细胞类器官模型的构建方法及其应用，涉及细胞模型构建技术领域。本发明专利技术方法以小鼠小肠类器官为造模细胞，将其诱导制成小鼠肠内分泌细胞类器官，待其分化后去掉细胞上清液，加入含脱氧雪腐镰刀菌烯醇的培养基继续培养，即得到所述小鼠肠内分泌细胞类器官模型。实验表明，使用脱氧雪腐镰刀菌烯醇能够诱导类器官模型中肠道食欲相关激素的表达发生显著变化，本发明专利技术获得的3D细胞模型的构建取代了传统的体外2D细胞模型，为进一步研究肠道激素紊乱的调控机制增加了可操作性和便利性，为基于肠道激素紊乱的肠道疾病提供了可靠和准确的研究工具，对肠道疾病相关研究的开展有着重大意义。意义。意义。

【技术实现步骤摘要】
一种基于肠道激素紊乱的小鼠肠内分泌细胞类器官模型的构建方法及其应用


[0001]本专利技术属于细胞模型构建
，具体为基于肠道激素紊乱的小鼠肠内分泌细胞类器官模型的构建方法及其应用。

技术介绍

[0002]肠道激素是指来源于肠道内分泌细胞和神经细胞的小分子活性物质和多肽，作为神经信号的传递物质，也被称为脑肠肽。它们对于维持消化道正常生理功能是必需的，这些激素相互之间、与肠道细胞、各种组织、器官之间互相协调才能维持机体生理功能，一旦这种平衡被打破，这种激素紊乱就会引发疾病(功能性消化不良、肠易激综合征、超重/肥胖等)。随着人们经济条件的改善，肠道相关疾病的患病率在全球范围持续上升。其中，据WHO数据显示肥胖人数超过20亿，占世界人口的30％。因此，如果存在一种基于肠道激素紊乱的体外模型，对于寻找肠道激素紊乱相关疾病的早期诊断指标及药物，开展针对其调控机制的基础研究尤为重要。
[0003]脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)是天然的单端孢霉烯族毒素，属于次级代谢物。由于其能够通过脑肠轴调节机体的呕吐及厌食行为，对肠道激素发挥调控作用。此外，应用体内动物模型和体外2D培养的细胞系模拟疾病的发生和发展，是寻找机体疾病潜在分子机制和治疗靶点的主要方式。然而，体外模型始终停留在细胞系水平，以单层形式培养，与生物体内的肠内分泌细胞的真实细胞环境、遗传背景和功能特性上存在较大差异。尽管体外2D细胞模型在基础研究中提供了极大帮助，但日益增加的肠道疾病患病率表明研究仍不充分。由于动物模型及细胞系模型的局限性，亟待提供一个有效且可靠的体外模型开展肠道激素紊乱的相关研究，从而代替传统细胞系模型，更好地，更准确地反映疾病的指标变化，以及发现研制药物的关键分子。
[0004]迄今，尚未见使用DON处理小鼠肠内分泌细胞类器官的方法建立基于肠道激素紊乱的小鼠肠内分泌细胞类器官模型的报道。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种基于肠道激素紊乱的小鼠肠内分泌细胞类器官模型的构建方法，为进一步研究肠道激素紊乱的调控机制增加可操作性和便利性，为基于肠道激素紊乱的肠道疾病提供可靠和准确的研究工具。
[0006]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：
[0007]本专利技术提供了一种基于肠道激素紊乱的小鼠肠内分泌细胞类器官模型的构建方法，包括如下步骤：使用0.5μM～2μM脱氧雪腐镰刀菌烯醇处理小鼠肠内分泌细胞类器官0.5～2h，获得基于肠道激素紊乱的小鼠肠内分泌细胞类器官模型。
[0008]优选地，所述小鼠肠内分泌细胞类器官是将小鼠小肠类器官传代培养后于诱导培养基培养得到。
[0009]优选地，所述诱导培养基的组分包括ENR培养基10～15ml，Mek抑制剂PD03259010.5～2μM、Wnt抑制剂IWP
‑
22～8μM和Notch抑制剂DAPT 5～15μM。
[0010]优选地，所述小鼠小肠类器官的制备方法包括：取小鼠小肠组织依次进行清洗、剪切、消化、裂解及过滤，离心，获得小鼠小肠干细胞沉淀，经培养获得小鼠小肠类器官。
[0011]更优选地，所述培养的方法包括将小鼠小肠干细胞沉淀于ENR培养基中37℃，5％CO2下培养。
[0012]更优选地，所述清洗的方法包括将剪切后的组织片段经4℃预冷含1％青链霉素的无菌PBS缓冲液多次清洗。
[0013]更优选地，所述裂解的方法包括将组织片段重悬于含有0.1％BSA的PBS中，移液管上下吹打。
[0014]更优选地，所述过滤的滤网孔径为50～80μm。
[0015]本专利技术还提供了一种所述构建方法构建得到的基于肠道激素紊乱的小鼠肠内分泌细胞类器官模型。
[0016]本专利技术还提供了一种所述基于肠道激素紊乱的小鼠肠内分泌细胞类器官模型在筛选治疗肠道激素紊乱药物中的应用。
[0017]相对于现有技术，本专利技术具有如下有益效果：
[0018](1)本专利技术方法构建的小鼠肠道内分泌细胞诱导模型，可以显著诱导Lgr5
+
肠干细胞向肠内分泌细胞定向分化，更有利于肠道激素紊乱模型的成功构建。
[0019](2)本专利技术提供了一种可以代替传统细胞系模型，能够更好地、更准确地反映疾病的指标变化，对于寻找肠道激素紊乱相关疾病的早期诊断指标及药物，开展针对其调控机制的基础研究具有重大意义。
附图说明
[0020]图1是本专利技术基于肠道激素紊乱的小鼠肠内分泌细胞类器官模型构建示意图；
[0021]图2是脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)对肠道类器官细胞活性的影响；
[0022]图3是DON对肠道类器官拒食激素CCK、GIP和GLP
‑
1分泌的影响；
[0023]图4是DON对肠道类器官促食激素Ghrelin分泌的影响。
具体实施方式
[0024]本专利技术提供了一种基于肠道激素紊乱的小鼠肠内分泌细胞类器官模型的构建方法，包括如下步骤：使用0.5μM～2μM脱氧雪腐镰刀菌烯醇处理小鼠肠内分泌细胞类器官0.5～2h，获得基于肠道激素紊乱的小鼠肠内分泌细胞类器官模型。优选地，使用0.8μM～1μM脱氧雪腐镰刀菌烯醇处理小鼠肠内分泌细胞类器官1h，获得基于肠道激素紊乱的小鼠肠内分泌细胞类器官模型。
[0025]在本专利技术中，所述小鼠肠内分泌细胞类器官是将小鼠小肠类器官传代培养后于诱导培养基培养得到。在本专利技术的具体实施例中，将小鼠小肠类器官传代3～5次，待Matrigel基质胶凝固后，加入诱导培养基培养。分化开始每2天更新一次诱导培养基，分化4天后，离心，重悬于4℃Advanced DMEM，离心重悬于Advanced DMEM和Matrigel基质胶中，铺板，待
Matrigel基质胶完全凝固加入Advanced DMEM，以待后期处理即可。
[0026]在本专利技术中，所述诱导培养基的组分优选地包括ENR培养基10～15ml，Mek抑制剂PD03259010.5～2μM、Wnt抑制剂IWP
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22～8μM和Notch抑制剂DAPT 5～15μM；更优选地，所述诱导培养基的组分包括ENR培养基12ml，Mek抑制剂PD03259011μM、Wnt抑制剂IWP
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25μM和Notch抑制剂DAPT10μM。在本专利技术中，Mek抑制剂PD0325901、Wnt抑制剂IWP
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2和Notch抑制剂DAPT均购自MedChemExpress生物试剂公司。在本专利技术的具体实施例中，所述ENR培养基组成为Advanced DMEM培养基12ml，Glutamax120μL(Thermo Scientific)、Hepes buffer 120μL(Thermo Scientific)、N
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2supplement 120μL(Thermo Scientific)、B
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于肠道激素紊乱的小鼠肠内分泌细胞类器官模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：使用0.5μM～2μM脱氧雪腐镰刀菌烯醇处理小鼠肠内分泌细胞类器官0.5～2h，获得基于肠道激素紊乱的小鼠肠内分泌细胞类器官模型。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述小鼠肠内分泌细胞类器官是将小鼠小肠类器官传代培养后于诱导培养基培养得到。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述诱导培养基的组分包括ENR培养基10～15ml，Mek抑制剂PD03259010.5～2μM、Wnt抑制剂IWP
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22～8μM和Notch抑制剂DAPT5～15μM。4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述小鼠小肠类器官的制备方法包括：取小鼠小肠组织依次进行清洗、剪切、消化、裂解及过滤，离心，...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴文达，徐宝才，秦子慧，乐建铭，张杰，李图帅，李泽琳，
申请(专利权)人：合肥工业大学，
类型：发明
国别省市：