一种用于秋刀鱼源性成分检测的引物和探针组合、试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术涉及基因检测技术领域，具体公开一种用于秋刀鱼源性成分检测的引物和探针组合、试剂盒及其应用。所述检测秋刀鱼源性成分的引物和探针中，上游引物的序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO:2所示，探针的序列如SEQ ID NO:3所示。本发明专利技术通过设计的引物和探针组合，建立了一种针对秋刀鱼源性成分的实时荧光PCR检测方法，该方法的特异性强，与鳕鱼、罗非鱼、鲅鱼、巴沙鱼、金枪鱼、鲤鱼、三文鱼和低眼巨鲶等均无交叉扩增反应，灵敏度高、最低检测限可达10pg/μL，准确度好，对秋刀鱼的准确快速鉴别和食品安全保障具有重要的意义。义。义。

【技术实现步骤摘要】
一种用于秋刀鱼源性成分检测的引物和探针组合、试剂盒及应用


[0001]本专利技术涉及基因检测
，尤其涉及一种用于秋刀鱼源性成分检测的引物和探针组合、试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]秋刀鱼(Cololabis saira)属于脊索动物门(Chordata)、颌针鱼目(Beloniformes)、竹刀鱼科(Scomberesocidae)秋刀鱼属(Cololabis)，是秋刀鱼属的唯一一种，也是重要的食用鱼类之一。秋刀鱼体内含有丰富的蛋白质、脂肪以及微量元素等，还含有人体所需的多种氨基酸、维生素以及锰、铁、锌等丰富的微量元素，是一种优质的动物性蛋白鱼类。除了含有人体所需的高消化吸收率的蛋白质之外，它所含有的DHA成分具有抑制乳腺癌、大肠癌、肺癌等功效，还具有提高人体学习机能及防止老年性痴呆症的效果，具有“脑黄金”的美誉。且秋刀鱼肉质细致，味道鲜美，深受人们的喜爱。
[0003]秋刀鱼目前主要以鲜销为主，其加工制品主要集中在加工成咸干品、休闲食品、调味品、鱼糜制品等。但是，秋刀鱼体内存在产组胺的微生物，在适宜条件下极易产生组胺，属于高组胺鱼类。食用高组胺鱼肉后，敏感人群会表现出皮疹、荨麻疹、呕吐、头痛等不适症状，也即出现组胺中毒问题。因此，建立一种准确定量检测鱼肉制品中秋刀鱼源性成分的方法，对于防止敏感人群食入秋刀鱼肉制品后过敏现象的发生具有重要意义。

技术实现思路

[0004]鉴于此，本专利技术提供一种用于秋刀鱼源性成分检测的引物和探针组合、试剂盒及其应用，利用该检测秋刀鱼的引物和探针可快速准确地检测出鱼肉制品中是否含有秋刀鱼源性成分，且特异性好，灵敏度高，具有较高的实用价值。
[0005]为达到上述专利技术目的，本专利技术实施例采用了如下的技术方案：
[0006]第一方面，本专利技术提供一种用于秋刀鱼源性成分检测的引物和探针组合，包括引物对和探针，所述引物对的序列如下：
[0007]上游引物
‑
F:5
′‑
TATTGCAACAGCCTTCTCATCAG
‑3′
(SEQ ID NO:1)，
[0008]下游引物
‑
R:5
′‑
TTGCATGCATATTTCGGATAAGTC
‑3′
(SEQ ID NO:2)；
[0009]所述探针P的序列为:5
′‑
CGCCCATATCTGCCGAGACGTGA
‑3′
(SEQ ID NO:3)。
[0010]本专利技术以秋刀鱼线粒体细胞色素b(Cytb)基因序列为基础设计引物对和探针，提供的引物和探针组合可以特异性地扩增出秋刀鱼源性成分的DNA，准确检测出秋刀鱼源性成分；且与鳕鱼、罗非鱼、鲅鱼、巴沙鱼、金枪鱼、鲤鱼、三文鱼和低眼巨鲶等均无交叉扩增反应，特异性强；且上述引物和探针的灵敏度高，对秋刀鱼源性成分DNA的最低检测限为10pg/μL，能够实现秋刀鱼源性成分的快速检测，同时，检测的准确度高，用时短，填补了秋刀鱼检测的空白，对于保障大众的饮食健康具有重要的意义，在鱼肉制品的快速检测领域具有良好的应用前景。
[0011]优选的，所述探针的5
′
端标记有荧光素，3
′
端标记有荧光猝灭基团。
[0012]进一步地，所述荧光素为FAM，所述荧光猝灭基团为Eclipse。
[0013]进一步地，所述探针P为：5
′‑
FAM
‑
CGCCCATATCTGCCGAGACGTGA
‑
Eclipse
‑3′
。
[0014]第二方面，本专利技术还提供了上述任一项所述的用于秋刀鱼源性成分检测的引物和探针组合在非诊断性检测鱼肉制品中秋刀鱼源性成分中的应用。
[0015]第三方面，本专利技术还提供了一种用于检测秋刀鱼源性成分的试剂盒，包含上述任一项所述的用于秋刀鱼源性成分检测的引物和探针组合。
[0016]优选的，所述试剂盒还包括PerfectStart II Probe qPCR SuperMix和ddH2O。
[0017]第四方面，本专利技术还提供利用上述试剂盒检测鱼肉制品中秋刀鱼源性成分的方法，具体操作为：提取待测物的基因组DNA为模板，用所述试剂盒进行real
‑
time PCR扩增，扩增完成后收集荧光信号。
[0018]上述检测鱼肉制品中秋刀鱼源性成分的方法，耗时短、操作简单、反应结果直观，能够快速准确的从众多鱼肉中检测出秋刀鱼，对秋刀鱼的准确快速鉴别和食品安全保障具有重要的意义。
[0019]优选的，所述real
‑
time PCR扩增的反应体系包括以下试剂及用量：2
×
PerfectStart II Probe qPCR SuperMix 12.5μL，上游引物和下游引物各1μL，探针1μL，DNA模板1μL，ddH2O补足至25μL；其中，所述上游引物和下游引物的浓度均为10μmol/L，所述探针的浓度为10μmol/L，所述DNA模板的浓度为100ng/μL。
[0020]优选的，所述real
‑
time PCR扩增的条件为：95℃30s；95℃5s，退火温度为60℃35s，40个循环。
[0021]上述优选的反应条件可进一步提高秋刀鱼源性成分的检测效率。
[0022]本专利技术提供的用于秋刀鱼源性成分检测的引物和探针组合，具有特异性强、灵敏度高的特点，可以快速鉴别出鱼肉制品中是否含有秋刀鱼源性成分，对于防止敏感人群食入含秋刀鱼鱼肉制品后过敏现象的发生具有重要意义，并且能够从含有多种鱼源性成分的鱼肉制品中特异性扩增出秋刀鱼源性成分的DNA，为鉴定秋刀鱼制品真伪提供了有效手段，填补了秋刀鱼检测的空白，在鱼肉制品检测领域具有较高的实用价值。
附图说明
[0023]图1是本专利技术实施例2中以Cytb基因设计的引物(F1/R1)和探针(P1)的特异性检测结果，其中，1：秋刀鱼；2：金枪鱼；3：巴沙鱼；4：鲤鱼；5：三文鱼；6：低眼巨鲶；7：虹鳟；8：大马哈鱼；9：鲶鱼；10：鳕鱼；11：罗非鱼；12：鲅鱼；
[0024]图2是本专利技术实施例2中以ATP
‑
6基因设计的引物(F2/R2)和探针(P2)的特异性检测结果，其中，1：秋刀鱼；2：金枪鱼；3：巴沙鱼；4：鲤鱼；5：三文鱼；6：低眼巨鲶；7：虹鳟；8：大马哈鱼；9：鲶鱼；10：鳕鱼；11：罗非鱼；12：鲅鱼；
[0025]图3是本专利技术实施例3中real
‑
time PCR方法的灵敏度试验结果图；其中，1的模板浓度为1.0
×
105pg/μL，2的模板浓度为1.0
×
104pg/μL，3的模板浓度为1.0
×
103pg/μL，4的模板浓度为1.0
×
102pg/μL，5的模板浓度为1.0<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于秋刀鱼源性成分检测的引物和探针组合，其特征在于，包括引物对和探针，所述引物对的序列如下：上游引物
‑
F：5
′‑
TATTGCAACAGCCTTCTCATCAG
‑3′
,下游引物
‑
R：5
′‑
TTGCATGCATATTTCGGATAAGTC
‑3′
；所述探针P的序列为：5
′‑
CGCCCATATCTGCCGAGACGTGA
‑3′
。2.如权利要求1所述的用于秋刀鱼源性成分检测的引物和探针组合，其特征在于，所述探针的5
′
端标记有荧光素，3
′
端标记有荧光猝灭基团。3.如权利要求2所述的用于秋刀鱼源性成分检测的引物和探针组合，其特征在于，所述荧光素为FAM，所述荧光猝灭基团为Eclipse。4.如权利要求3所述的用于秋刀鱼源性成分检测的引物和探针组合，其特征在于，所述探针P为：5
′‑
FAM
‑
CGCCCATATCTGCCGAGACGTGA
‑
Eclipse
‑3′
。5.权利要求1
‑
4任一项所述的用于秋刀鱼源性成分检测的引物和探针组合在非诊断性检测鱼肉制...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘立兵，王建昌，项佳林，付琦，王金凤，孙晓霞，艾连峰，
申请(专利权)人：石家庄海关技术中心，
类型：发明
国别省市：