【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于检测样品中的一种或多种靶分析物的试剂盒及其制造和使用方法
[0001]本公开涉及用于检测样品中的一种或多种靶分析物的试剂盒及其制造和使用方法。
技术介绍
[0002]单核苷酸多态性(SNP)是指生物体的基因组中的单核苷酸变异，其中存在各自在群体的相当大部分(>1％)中出现的两个或更多个不同核苷酸残基(等位基因)。SNP是个体间序列变异的最常见形式，并且与许多遗传性疾病的病因有关。Wang等人(1998),《人类基因组中单核苷酸多态性的大规模鉴别、作图和基因分型(Large
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Scale Identification,Mapping,and Genotyping of Single
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Nucleotide Polymorphisms in the Human Genome)》,《科学(Science)》,280:1077
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1082。人类基因组中估计存在1000万个SNP，其可能发生在编码区和非编码区中。Kruglyak等人(2001)《变异是生命的额外趣味(Variation is the Spice of Life)》,《自然
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遗传学(Nat.Genet.)》,27:234
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236。许多SNP对细胞功能没有影响，但其它SNP与遗传性状、遗传疾病、年龄相关疾病以及对药物和环境因素的反应相关。
[0003]基因分型分析是用于检测样品中核苷酸序列的存在的基因测试，并且可以用于检测样品中SNP或其它序列变...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种检测样品中包含靶核酸序列的靶寡核苷酸的方法，所述方法包含：(a)使所述样品与包含寡核苷酸标签、靶互补序列和检测寡核苷酸的检测探针在如下条件下接触：所述靶互补序列与所述靶寡核苷酸的所述靶核酸序列杂交，以形成反应产物；(b)使上面固定有捕获寡核苷酸的支撑表面与含有所述反应产物的混合物在如下条件下接触：所述反应产物的所述寡核苷酸标签与所述捕获寡核苷酸杂交，以形成固定化检测复合物；(c)使所述固定化检测复合物与包含扩增模板的检测混合物接触；(d)扩增所述扩增模板以形成包含一个或多个包含检测标记位点的核酸序列的扩增子；(e)使所述扩增子与包含标记和与所述检测标记位点互补的核酸序列的检测试剂在如下条件下接触：所述检测试剂的所述核酸序列与所述扩增子的所述检测标记位点杂交；以及(f)检测结合到所述检测标记位点的所述标记。2.根据权利要求1所述的方法，其中在(a)中使所述样品与锚定试剂和所述检测探针接触，其中所述锚定试剂包含寡核苷酸标签和锚定序列。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述检测探针包含单链DNA寡核苷酸标签、单链RNA靶互补序列和单链DNA检测寡核苷酸。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述锚定试剂包含单链DNA寡核苷酸标签和单链DNA锚定序列。5.根据权利要求3或4所述的方法，其包含在(c)之前使所述固定化检测复合物与RNA酶接触以消化未结合探针的单链RNA。6.一种检测样品中包含靶核酸序列的靶寡核苷酸的方法，所述方法包含：(a)使所述样品与以下接触：(i)检测探针，其包括包含单链DNA序列的寡核苷酸标签、包含单链RNA序列的靶互补序列和包含单链DNA序列的检测寡核苷酸；和(ii)锚定试剂，其包括包含单链DNA序列的寡核苷酸标签和包含单链DNA序列的锚定序列，其中所述检测探针的所述靶互补序列与所述靶寡核苷酸的所述靶核酸序列杂交以形成反应产物，其包含所述寡核苷酸标签、包含所述靶寡核苷酸的所述靶核酸序列和所述靶互补序列的双链RNA双链体；(b)使包含上面在离散结合域中固定有多种捕获寡核苷酸的一个或多个电极的支撑表面与包含所述反应产物的混合物在如下条件下接触：所述反应产物的所述寡核苷酸标签与所述捕获寡核苷酸杂交，以在所述支撑表面上形成检测复合物；(c)使所述支撑表面与RNA酶接触以消化未结合检测探针的单链RNA；(d)使固定化检测复合物与包含滚环扩增(RCA)模板和聚合酶的检测混合物接触；(e)通过RCA扩增所述模板以形成连接到所述检测复合物的延伸序列，其中所述延伸序列包含多个包含检测标记位点的核酸序列；(f)使所述延伸序列与包含电化学发光(ECL)标记和与所述延伸序列的所述检测标记位点互补的核酸序列的检测试剂在如下条件下接触：所述检测试剂的所述核酸序列与所述
检测标记位点杂交；以及(g)通过使所述ECL标记与包含ECL共反应物的ECL读取缓冲液接触并且向所述电极施加电势来检测结合到所述延伸序列的所述ECL标记。7.一种检测样品中的靶核苷酸序列的方法，所述方法包含：(a)使所述样品与包含以下的混合物接触：(i)靶向探针，其包含单链寡核苷酸标签和与所述样品中的所述靶核苷酸序列的第一区互补的第一核酸序列；和(ii)检测探针，其包含检测寡核苷酸和与所述靶核苷酸序列的第二区互补的第二核酸序列，其中所述靶向探针的所述第一核酸序列和所述检测探针的所述第二核酸序列与所述靶寡核苷酸的相邻核酸序列互补；(b)在核酸连接酶存在下，在如下条件下培育包含所述靶寡核苷酸、所述靶向探针和所述检测探针的所述混合物：所述靶向探针和所述检测探针结合到其相应的所述靶寡核苷酸的核苷酸序列，并且所述核酸连接酶连接所述靶向探针和所述检测探针，以形成包含所述寡核苷酸标签和所述检测寡核苷酸的反应产物；(c)使上面固定有捕获寡核苷酸的支撑表面与包含所述反应产物的所述混合物在如下条件下接触：所述反应产物的所述寡核苷酸标签与所述捕获寡核苷酸杂交，以形成固定化检测复合物；(d)使所述固定化检测复合物与包含扩增模板的检测混合物接触；(e)扩增所述扩增模板以形成包含一个或多个包含检测标记位点的核酸序列的扩增子；(f)使所述扩增子与包含标记和与所述检测标记位点互补的核酸序列的检测试剂在如下条件下接触：所述检测试剂的所述核酸序列与所述检测标记位点杂交；以及(g)检测结合到所述支撑表面的所述标记。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述检测探针具有与和所述靶向探针的3'端相邻的靶核苷酸序列杂交的5'端。9.根据权利要求7所述的方法，其包含使(b)中形成的所述反应产物暴露于变性条件以使所述反应产物与所述靶寡核苷酸解离。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述扩增模板通过聚合酶链反应(PCR)扩增。11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述扩增模板通过滚环扩增(RCA)扩增。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述扩增模板包含环状扩增模板。13.根据权利要求11或12所述的方法，其中由RCA生成的所述扩增子包含连接到所述固定化检测复合物的延伸序列。14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述扩增子包含多个检测标记位点。15.根据权利要求11所述的方法，其中所述扩增模板包含线性扩增模板，其包含5'末端核苷酸序列和3'末端核苷酸序列，其中所述5'末端核苷酸序列和所述3'末端核苷酸序列能够与所述检测序列杂交；以及能够与所述检测试剂的所述核酸序列的互补序列杂交的内部
核苷酸序列，其中所述扩增模板的所述5'末端核苷酸序列和所述3'末端核苷酸序列不与所述内部序列重叠。16.根据权利要求11所述的方法，其中所述扩增模板包含线性扩增模板，其包含5'末端核苷酸序列和3'末端核苷酸序列，其中所述5'末端核苷酸序列和所述3'末端核苷酸序列能够与所述检测序列杂交；能够与锚定寡核苷酸序列的互补序列杂交的第一内部序列以及能够与所述检测试剂的所述核酸序列的互补序列杂交的第二内部序列，其中所述扩增模板的所述5'末端核苷酸序列和所述3'末端核苷酸序列不与所述第一内部序列和所述第二内部序列重叠。17.根据权利要求16所述的方法，其中所述3'末端序列和所述5'末端序列的长度的总和为约14到约24个核苷酸的长度。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述3'末端序列和所述5'末端序列的长度的总和为约14或约15个核苷酸的长度。19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述扩增模板包含5'
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GTTCTGTC
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3'(SEQ ID NO:1666)的5'末端序列和5'
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GTGTCTA
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3'(SEQ ID NO:1667)的3'末端序列。20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述检测寡核苷酸包含与所述扩增模板的所述5'末端序列互补的第一序列和与所述扩增模板的所述3'末端序列互补的相邻第二序列。21.根据权利要求19或20所述的方法，其中所述扩增模板包含5'
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CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG
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3'(SEQ ID NO:1668)的核苷酸序列。22.根据权利要求19或20所述的方法，其中所述扩增模板包含5'
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AAGAGAGTAGTACAGCA
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3'(SEQ ID NO:1669)的核苷酸序列。23.根据权利要求19或20所述的方法，其中所述扩增模板包含由5'
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GTTCTGTCATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGTACAGCAAGAG TGTCTA
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3'(SEQ ID NO:1670)组成的序列。24.根据权利要求19或20所述的方法，其中所述扩增模板包含5'
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GCTGTGCAATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGTACAGCAAGAG CGTCGA
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3'(SEQ ID NO:1671)的核苷酸序列。25.根据权利要求23或24所述的方法，其中所述检测寡核苷酸包含5'
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GACAGAACTAGACAC
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3'(SEQ ID NO:1664)的14或15个连续核苷酸。26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述扩增模板包含长度为约50到约78个核苷酸的非天然存在的寡核苷酸序列。27.根据权利要求26所述的方法，其中所述扩增模板的所述非天然存在的寡核苷酸序列的长度为约53到约76个核苷酸、约50到约70个核苷酸、约53到约61个核苷酸或约54到约61个核苷酸。28.根据权利要求26或27所述的方法，其中所述扩增模板的所述非天然存在的寡核苷酸序列的长度为约53、约54、约55、约56、约57、约58、约59、约60、约61、约62、约63、约64、约65、约66、约67、约68、约69、约70、约71、约72、约73、约74、约75或约76个核苷酸。29.根据权利要求26到28中任一项所述的方法，其中所述扩增模板的所述非天然存在的寡核苷酸序列的长度为约61个核苷酸。30.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述检测试剂的所述核酸序列包含与以下的14或15个连续核苷酸具有至少90％序列同一性的核酸序列：5'
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CAGTGAATGCGAGTCCGTCT
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3'(SEQ ID NO:1672)。31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述检测试剂的所述核酸序列包含5'
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CAGTGAATGCGAGTCCGTCT
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3'(SEQ ID NO:1672)。32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述检测试剂的所述核酸序列包含5'
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CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG
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3'(SEQ ID NO:1668)。33.根据权利要求2到32中任一项所述的方法，其中所述锚定试剂的所述锚定序列包含长度为约10到约30个核酸的寡核苷酸。34.根据权利要求2到33中任一项所述的方法，其中所述锚定试剂的所述锚定序列包含长度为约17或约25个寡核苷酸的寡核苷酸。35.根据权利要求2到33中任一项所述的方法，其中所述锚定试剂的所述锚定序列包含5'
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AAGAGAGTAGTACAGCA
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3'(SEQ ID NO:1669)。36.根据权利要求2到33中任一项所述的方法，其中所述锚定试剂的所述锚定序列由5'
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AAGAGAGTAGTACAGCAGCCGTCAA
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3'(SEQ ID NO:1665)组成。37.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述支撑表面包含一个或多个碳基电极。38.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述支撑表面包含多孔板，所述多孔板包含一个或多个碳基电极。39.根据权利要求38或39所述的方法，其中所述电极包含碳墨电极。40.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述支撑表面包含多孔板，所述多孔板包含一个或多个碳基电极，并且其中多种捕获寡核苷酸固定在所述碳基电极上的离散域中。41.根据权利要求40所述的方法，其中所述多种捕获寡核苷酸固定所述支撑表面上阵列中的离散结合域中。42.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述标记包含电化学发光(ECL)标记。43.根据权利要求42所述的方法，其包含通过使所述电极与包含电化学发光共反应物的电化学发光读取缓冲液接触并且向所述电极施加电势来生成分析信号的步骤。44.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中固定在所述支撑表面上的所述捕获寡核苷酸选自符合以下要求中的一者或多者的非交叉反应性寡核苷酸的集合：(a)约40％与约50％之间的GC含量；(b)约30％与约70％之间的AG含量；(c)约30％与约70％之间的CT含量；(d)不超过三个的序列中的最大碱基重复串；(e)没有不需要的与连续超过7个互补碱基对匹配的串的寡核苷酸
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寡核苷酸相互作用；(f)没有不需要的与18个连续碱基或更少的串的寡核苷酸
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寡核苷酸相互作用，其中：(i)每一端的末端碱基是互补匹配；和(ii)互补碱基对匹配之和减错配之和大于7；
(g)没有20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个碱基对或更长的串匹配基因组中或自然界中的序列或序列的互补序列或两者；(h)序列与其互补序列的杂交自由能差异小于约1kCal/mol、约2kCal/mol、约3kCal/mol或约4kCal/mol；(i)没有在茎中具有4个或更多个连续匹配的预测发夹环；以及(j)没有在茎中具有4个或更多个连续匹配且环大小大于6个碱基的预测发夹环。45.根据权利要求44所述的方法，其中固定在所述支撑表面上的所述捕获寡核苷酸选自：(a)具有选自SEQ ID No:1
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64的序列的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核苷酸的捕获寡核苷酸；(b)包含与选自SEQ ID No:1
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64的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列的捕获寡核苷酸；(c)具有与选自SEQ ID No:1
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64的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核苷酸的捕获寡核苷酸；(d)包含选自SEQ ID No:1
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64的序列的捕获寡核苷酸；以及(e)选自(a)
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(d)中的任一者的捕获寡核苷酸。46.根据权利要求44所述的方法，其中固定在所述支撑表面上的所述捕获寡核苷酸选自：(a)包含具有选自SEQ ID No:1
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10的序列的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连续核苷酸的序列的捕获寡核苷酸；(b)包含与选自SEQ ID No:1
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10的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列的捕获寡核苷酸；(c)具有与选自SEQ ID No:1
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10的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列的至少20、21...
【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：中尺度技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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