一种TaqDNA聚合酶突变体制造技术

本发明专利技术公开了一种Taq DNA聚合酶突变体，是将序列如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列进行以下任一组中的任一种突变所得的突变体：(1)Y686R/E687K、Y686R/E687K/Q690G、Y686R/E687K/Q690V、Y686R/E687K/D732A、Y686R/E687K/A744G；(2)E507Q、R716K；(3)E734N。本发明专利技术Taq DNA聚合酶突变体相较于野生型酶在热稳定性、活性或者灵敏度方面得到提高，使扩增效果更加好。果更加好。果更加好。

【技术实现步骤摘要】
一种Taq DNA聚合酶突变体


[0001]本专利技术涉及酶工程
，具体涉及一种Taq DNA聚合酶突变体。

技术介绍

[0002]Taq DNA聚合酶的基因全长为2496bp，编码832aa，分子量大小为94kD，是一种耐热的聚合酶，属于DNA聚合酶I家族。Taq DNA聚合酶有三个结构域，N端结构域(1～290)具有一个5
’→3’
核酸外切酶活性，金属离子(Zn
2+
和Mg
2+
)的结合位点也位于该区域。C端(424～832)具有5
’→3’
聚合酶反应的结构域，该结构域状若人之右手，主要由拇指、手指和手掌三个结构域构成。拇指区域主要作用是结合引物
‑
模板的复合物，手指区域负责与单链DNA模板相互作用及接纳脱氧核糖核苷酸dNTPs，且每接纳一个核苷酸dNTP，手指指尖部分就会向内侧移动而形成闭合结构。手掌区域的功能是催化脱氧核糖核酸核苷酸聚合反应，同时也能起到接纳dNTP的作用。Taq DNA聚合酶的第三个结构域(292～423)与大肠杆菌的DNA聚合酶Pol I具有结构同源性但序列相似度不高，所以TaqDNA聚合酶不具有大肠杆菌DNA聚合酶Pol I的3
’→5’
核酸外切酶活性，在合成当中对于单核苷酸的错配不具有校正功能，从而不能使产物具有好的保真性。Taq DNA聚合酶最适温度为70～75℃(催化活性最高的温度)，其催化延伸效率可达150bp/s。Taq DNA聚合酶在92.5℃酶活性可持续130min，95℃持续40min，97.5℃下5
‑
6min可保持约50％的酶活性。研究者将Taq DNA聚合酶应用于PCR技术，使得PCR的过程实现了自动连续循环。
[0003]Taq DNA聚合酶广泛用于基因工程技术，包括DNA克隆、基因诱变、DNA标记、测序和其他体外DNA操作。Taq DNA聚合酶在RT
‑
PCR中发挥了至关重要的作用。不仅如此，Taq DNA聚合酶在其他人畜流行疾病的诊断和检测中也有十分广泛的应用，例如非洲猪瘟检测等。尽管如此，TaqDNA聚合酶仍存在一些不足之处，稳定性、检测灵敏性、活性等仍然有待进一步提高。随着PCR和RT
‑
PCR技术的普遍应用，对Taq DNA聚合酶性质的研究日渐重要。
[0004]因此，通过蛋白工程的手段增强Taq DNA聚合酶的热稳定性、灵敏度以及PCR活性可以扩展现有应用范围，也可以设计新的应用形式，而且对于提升Taq DNA聚合酶的临床诊断具有重要的意义。
[0005]公开号为CN114774384A的专利技术申请公开了一种Taq DNA聚合酶突变体及其筛选方法，该Taq DNA聚合酶突变体是通过对732位进行饱和突变后筛选获得的，与未经改造的野生型Taq酶相比，特异性和活性均有明显的提高，但热稳定性、活性、灵敏度等方面都还待进一步提高。

技术实现思路

[0006]本专利技术针对现有技术中存在的上述不足，提供了一种Taq DNA聚合酶突变体。
[0007]一种Taq DNA聚合酶突变体，是将序列如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列进行以下任一组中的任一种突变所得的突变体：
[0008](1)Y686R/E687K、Y686R/E687K/Q690G、Y686R/E687K/Q690V、Y686R/E687K/D732A、
Y686R/E687K/A744G；
[0009](2)E507Q、R716K；
[0010](3)E734N。
[0011]本专利技术又提供了所述Taq DNA聚合酶突变体的编码基因。
[0012]本专利技术又提供了一种包含所述编码基因的重组载体。
[0013]本专利技术又提供了一种包含所述编码基因的基因工程菌。
[0014]本专利技术又提供了一种制备所述Taq DNA聚合酶突变体的方法，包括以下步骤：发酵培养所述基因工程菌，然后分离纯化获得所述Taq DNA聚合酶突变体。
[0015]本专利技术还提供了所述Taq DNA聚合酶突变体作为DNA聚合酶在DNA扩增中的应用。
[0016]本专利技术还提供了一种用于DNA扩增的试剂盒，包括所述Taq DNA聚合酶突变体。
[0017]优选的，DNA扩增为PCR或RT
‑
PCR。
[0018]本专利技术Taq DNA聚合酶突变体相较于野生型酶在热稳定性、活性或者灵敏度方面得到提高，使扩增效果更加好。
附图说明
[0019]图1为Taq DNA聚合酶与2756条同源序列的比对结果图。
[0020]图2为GREMLIN生成的Taq DNA聚合酶的共同进化图谱。
[0021]图3为嗜热微生物来源的DNA聚合酶的多序列比对预测了13个单突变结果图。
[0022]图4为突变体E507Q和R716K的qPCR初筛结果图(突变体和荧光曲线框在一起)。
[0023]图5为E507Q、R716K与野生型Taq DNA聚合酶的PCR电泳图，其中A图、B图、C图分别为不同条件下的检测结果，泳道M为标准分子量Marker，泳道Wild为野生型。
[0024]图6为突变体E507Q、E734N与野生型的Taq酶的PCR表现对比结果图，其中A图、B图分别为不同条件下的检测结果，泳道M为标准分子量Marker，泳道Wild为野生型，泳道507Q为突变体E507Q。
[0025]图7为突变体Y686R/E687K、Y686R/E687K/Q690G和Y686R/E687K/Q690V与野生型的Taq酶的PCR表现对比结果图，其中A图、B图分别为不同条件下的检测结果，泳道M为标准分子量Marker，泳道Wild为野生型，泳道RK为突变体Y686R/E687K，泳道RK690G为突变体Y686R/E687K/Q690G，泳道RK690V为突变体Y686R/E687K/Q690V。
[0026]图8为突变体Y686R/E687K/D732A和Y686R/E687K/A744G与野生型Taq酶的PCR表现对比结果图，其中泳道M为标准分子量Marker，泳道Wild为野生型，泳道RK732A为突变体Y686R/E687K/D732A，泳道RK744A为突变体Y686R/E687K/A744G，泳道2和泳道3为其他突变体。
[0027]图9为RT
‑
PCR等温扩增以确定Taq DNA聚合酶的活性。荧光强度与循环线性拟合野生型(Y＝250.5*X
‑
4113)、E507Q(Y＝636.0*X
‑
9886)和E734N(Y＝340.3*X
‑
5460)。线性方程的斜率是酶活性的指标。
具体实施方式
[0028]实施例1：突变体的设计
[0029](1)基于大规模多序列比对的突变体的理性设计
[0030]鉴于O...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Taq DNA聚合酶突变体，其特征在于，是将序列如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列进行以下任一组中的任一种突变所得的突变体：(1)Y686R/E687K、Y686R/E687K/Q690G、Y686R/E687K/Q690V、Y686R/E687K/D732A、Y686R/E687K/A744G；(2)E507Q、R716K；(3)E734N。2.权利要求1所述Taq DNA聚合酶突变体的编码基因。3.一种包含权利要求2所述编码基因的重组载体。4.一种包含权利要求2...

【专利技术属性】
技术研发人员：于浩然，李新佳，陈彬彬，陈婉姨，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：