一对可分裂重组的末端脱氧核苷酸核酸转移酶及构建方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其涉及一对可分裂重组的末端脱氧核苷酸核酸转移酶及构建方法。所述一对可分裂重组的末端脱氧核苷酸核酸转移酶包括由TdT经切割得到的两个TdT蛋白结构域，所述两个TdT蛋白结构域分别记为TdT

【技术实现步骤摘要】
一对可分裂重组的末端脱氧核苷酸核酸转移酶及构建方法


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一对可分裂重组的末端脱氧核苷酸核酸转移酶及构建方法与应用。

技术介绍

[0002]DNA人工合成技术是现代基因技术的重要基础。DNA人工合成的关键方法包括：柱式化学寡核苷酸合成、芯片化学寡核苷酸合成、寡核苷酸纯化、寡核苷酸拼装、基因合成纠错与克隆筛选、大片段基因合成组装，以及DNA的新一代酶法合成。DNA人工合成的传统方法大多依赖亚磷酰胺化学完成反应。近年来以酶促合成为原理的第三代DNA人工合成逐渐崛起，成为前景广阔的DNA人工合成方法。其中以末端脱氧核糖核苷转移酶(TdT)为核心的酶促合成技术是极具前景的DNA合成策略。
[0003]新型核苷酸酶促合成法是利用非模版依赖性的DNA末端核酸转移酶(TdT)进行体外的寡核苷酸片段合成。TdT由Bollum首先发现并提出该酶可用于单链寡核苷酸的合成。随后Schott和Schrade研究发现，TdT对四种核苷酸的偏好性差异小、偶联效率高，持续合成和延伸单链DNA可产生长达8000nt的均聚物。为了实现TdT催化的可控DNA合成，DNA合成酶的活性需要被可逆控制。Keasling团队在2018年构建的TdT催化活性控制机制利用了TdT与单个核苷酸的可逆共价键链接，用于阻止TdT催化合成的DNA链的进一步延伸。当该可逆共价键链接断裂后，DNA链便可进入新的核苷酸添加循环。该方法平均偶联效率可达97.7％，单个循环需2～3min。基于创新TdT的DNA合成得到了学术界和工业界的普遍关注。
[0004]由于TdT越发显著的DNA合成应用，针对TdT开展酶工程设计以实现TdT酶活性的灵活调控意义逐渐凸显。现有实现TdT酶活性调节的方法选择有限，主要依赖人工修饰的特异性脱氧核糖核苷酸作为TdT底物，并在底物分子3
’‑
OH上添加保护基团。该保护基团形成的空间位阻有效阻挡了下一个底物单体的连接过程。但在添加下一个碱基时，需要对3'末端的保护基团进行脱保护处理，然后才能进行下一步循环反应。因此，现有基于TdT的DNA合成仍需要多步反应才能实现，限制了酶法DNA合成的自动化程度。
[0005]针对该问题，本专利技术设计了可分裂重组的TdT结构域，进而通过控制TdT蛋白结构域(TdT
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D1，TdT
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D2)的相互作用显著调控TdT酶催化活性，不再需要依赖保护剂和去保护剂。
[0006]因此，现有技术还有待于改进和发展。

技术实现思路

[0007]鉴于上述现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一对可分裂重组的末端脱氧核苷酸核酸转移酶及构建方法与应用，旨在解决现有调节TdT酶活性的方法需要依赖保护剂和去保护剂，导致基于TdT的DNA合成仍需要多步反应才能实现的问题。
[0008]本专利技术的技术方案如下：
[0009]一对可分裂重组的末端脱氧核苷酸核酸转移酶，其中，包括由TdT经切割得到的两
个TdT蛋白结构域，所述两个TdT蛋白结构域分别记为TdT
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D1和TdT
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D2，当所述TdT
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D1和TdT
‑
D2分别单独存在时不独立表现出TdT催化活性；当所述TdT
‑
D1和TdT
‑
D2同时存在且靠近时，TdT
‑
D1和TdT
‑
D2会发生重组并表现出TdT催化活性。
[0010]可选地，所述TdT
‑
D1的N端连接有pMag，记为pMag
‑
TdT
‑
D1；所述TdT
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D2的C端连接有nMag，记为TdT
‑
D2
‑
nMag；
[0011]在蓝光照射前，所述pMag
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TdT
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D1和TdT
‑
D2
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nMag单独存在时不独立表现出TdT催化活性；
[0012]在蓝光照射下，pMag和nMag会二聚并使所述TdT
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D1和TdT
‑
D2靠近，TdT
‑
D1和TdT
‑
D2会发生重组并表现出TdT催化活性。
[0013]可选地，所述pMag
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TdT
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D1和TdT
‑
D2
‑
nMag的摩尔比为1:1。
[0014]可选地，所述TdT
‑
D1的N端通过第一连接子连接pMag，所述TdT
‑
D2的C端通过第一连接子连接nMag，所述第一连接子的氨基酸序列为GSGGSGGSGGSG。
[0015]可选地，所述由TdT经切割得到的两个TdT蛋白结构域具体包括：TdT删除了没有实质催化功能的1
‑
146氨基酸之后，剩余TdT经切割得到的两个TdT蛋白结构域；
[0016]其中，所述TdT的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述TdT删除了没有实质催化功能的1
‑
146氨基酸之后，剩余TdT的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0017]可选地，所述TdT
‑
D1的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述TdT
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D2的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0018]可选地，所述pMag
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TdT
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D1的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述TdT
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D2
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nMag的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0019]一对本专利技术所述的可分裂重组的末端脱氧核苷酸核酸转移酶的构建方法，其中，包括步骤：
[0020]提供TdT；
[0021]用第二连接子将所述TdT的N端和C端连接起来，在TdT上从N端开始逐段选择切割位点，构建出不同TdT变体形式；
[0022]从不同TdT变体形式中筛选出高表达水平和高催化活性的TdT变体，得到候选TdT变体；
[0023]将所述候选TdT变体中的第二连接子去除，得到所述TdT
‑
D1和TdT
‑
D2，且当所述TdT
‑
D1和TdT
‑
D2分别单独存在时不独立表现出TdT催化活性；当所述TdT
‑
D1和TdT
‑
D2同时存在且靠近时，TdT
‑
D1和TdT
‑
D2会发生重组并表现出TdT催化活性。
[0024]可选地，所述第二连接子的氨基酸序列为GTGGSGGTGG；
[0025]得到所述TdT
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D1、TdT
‑
D2后，还本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一对可分裂重组的末端脱氧核苷酸核酸转移酶，其特征在于，包括由TdT经切割得到的两个TdT蛋白结构域，所述两个TdT蛋白结构域分别记为TdT
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D1和TdT
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D2，当所述TdT
‑
D1和TdT
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D2分别单独存在时不独立表现出TdT催化活性；当所述TdT
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D1和TdT
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D2同时存在且靠近时，TdT
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D1和TdT
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D2会发生重组并表现出TdT催化活性。2.根据权利要求1所述的一对可分裂重组的末端脱氧核苷酸核酸转移酶，其特征在于，所述TdT
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D1的N端连接有pMag，记为pMag
‑
TdT
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D1；所述TdT
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D2的C端连接有nMag，记为TdT
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D2
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nMag；在蓝光照射前，所述pMag
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TdT
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D1和TdT
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D2
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nMag单独存在时不独立表现出TdT催化活性；在蓝光照射下，pMag和nMag会二聚并使所述TdT
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D1和TdT
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D2靠近，TdT
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D1和TdT
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D2会发生重组并表现出TdT催化活性。3.根据权利要求2所述的一对可分裂重组的末端脱氧核苷酸核酸转移酶，其特征在于，所述pMag
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TdT
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D1和TdT
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D2
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nMag的摩尔比为1:1。4.根据权利要求2所述的一对可分裂重组的末端脱氧核苷酸核酸转移酶，其特征在于，所述TdT
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D1的N端通过第一连接子连接pMag，所述TdT
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D2的C端通过第一连接子连接nMag，所述第一连接子的氨基酸序列为GSGGSGGSGGSG。5.根据权利要求1所述的一对可分裂重组的末端脱氧核苷酸核酸转移酶，其特征在于，所述由TdT经切割得到的两个TdT蛋白结构域具体包括：TdT删除了没有实质催化功能的1
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146氨基酸之后，剩余TdT经切割得到的两个TdT蛋白结构域；其中，所述TdT的氨基酸序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：阮华明，陈柳青，於邱黎阳，
申请(专利权)人：中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：