用于猪流行性腹泻病毒检测的引物、探针及试剂盒和方法技术

本发明专利技术中公开了用于猪流行性腹泻病毒PEDV检测的引物、探针及试剂盒，同时公开了利用该引物、探针或试剂盒对PEDV检测的RPA

【技术实现步骤摘要】
用于猪流行性腹泻病毒检测的引物、探针及试剂盒和方法


[0001]本专利技术涉及分子生物
，具体涉及一种用于猪流行性腹泻病毒检测的特异性引物、探针及试剂盒和利用该特异性引物、探针或试剂盒快速检测猪流行性腹泻病毒的方法。

技术介绍

[0002]猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea Virus,PEDV)引起的猪的一种常见胃肠道疾病，可感染所有年龄段的猪，其中哺乳仔猪感染死亡率较高。临床症状常以腹泻为主，成年猪可见厌食、呕吐、脱水和体重减轻等，与猪传染性胃肠炎(TGE)症状相似。该病毒主要有GI和GII两个毒株型，由于该病毒的经典疫苗毒株属于GI
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b亚群，而GI和GII毒株的基因关系并不密切，因此目前已有的疫苗(减毒CV777和DR13、GI基因组)对变异株(GII基因组)并不能提供完全的保护。PED也成为国内目前常见的重点防控动物疫病之一。只有及时发现并对患猪进行治疗，才能防止疾病的传播扩散，避免养殖损失。
[0003]目前国内常用PCR方法对PEDV进行检测，但该方法耗时长且对实验操作要求高，不能在采样现场就对PEDV进行快速准确的检测。因此，建立一种高效灵敏的快速现场检测方法具有重要意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于解决现有技术中存在的对猪流行性腹泻病毒PEDV进行检测耗时长、反应环境要求高、操作复杂的技术问题，提供一种用于猪流行性腹泻病毒检测的引物、探针及试剂盒和方法。
[0005]为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：用于猪流行性腹泻病毒检测的引物及探针，上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.7和SEQ IDNo.8所示；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。
[0006]本专利技术同时提供一种用于猪流行性腹泻病毒检测的试剂盒，包括上述引物及探针。
[0007]优选地，所述试剂盒还包括重组酶、恒温聚合酶、单链结合蛋白、辅助蛋白、核酸外切酶、dNTPs、聚乙二醇、Tris
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HCI和醋酸镁。
[0008]本专利技术同时提供了上述引物及探针或上述试剂盒在制备猪流行性腹泻病毒检测试剂中的应用。
[0009]本专利技术还提供了一种猪流行性腹泻病毒的检测方法，提取待测样品的RNA作为模板，利用上述引物及探针或上述试剂盒进行重组酶聚合酶扩增RPA，再对扩增产物进行侧流免疫层析检测LFD，观察LFD的反应条带即可得到检测结果。
[0010]优选地，所述重组酶聚合酶扩增的反应条件为：恒温37℃条件下反应20min。
[0011]本专利技术所具有的有益效果：
[0012]一)本专利技术中建立了针对PEDV检测的RPA
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LFD方法，即利用特异性引物和探针进行重组酶聚合酶扩增RPA，在37℃下反应20min，即可获得稳定的核酸扩增产物，并可通过LFD核酸试纸条经层析反应后获得可视扩增产物条带，可以对猪流行性腹泻病毒PEDV进行特异性检测，具有很强的特异性，仅PEDV检测为阳性，猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪伪狂犬病毒(PrV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)检测均为阴性；
[0013]二)本专利技术中建立的RPA
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LFD方法稳定性好，且灵敏性高，PEDV的最低检出限为7.295
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10copies/μL；
[0014]三)相比现有的PCR检测方法，本专利技术建立的RPA
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LFD方法样品处理更简化，且无需通过凝胶电泳显示结果，极大的缩短了检测时间，提高了检测效率；同时RPA
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LFD方法的操作简便，对反应环境要求不高，无需局限于实验室，在养殖场即可完成对PEDV的现场快速检测，有效提高了养殖场对PED的防控。
附图说明
[0015]图1为本专利技术实施例1中RPA扩增产物的凝胶电泳图；
[0016]图2为本专利技术实施例1中利用核酸试纸对RPA扩增产物进行LFD检测结果图；
[0017]图3为本专利技术实施例2中RPA
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LFD法对PEDV的特异性检测试验结果图；
[0018]图4为本专利技术实施例3中RPA
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LFD法对PEDV的灵敏度检测试验结果图；
[0019]图5为本专利技术实施例4中RPA
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LFD法对PEDV的重复性检测试验结果图；
[0020]图6为本专利技术实施例5中RT
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PCR法对临床样品的检测结果图；
[0021]图7为本专利技术实施例5中RPA
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LFD法对临床样品的检测结果图。
具体实施方式
[0022]下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步的说明。
[0023]本专利技术中猪流行性腹泻病毒(PEDV)分离株SHpd/2012由上海交通大学人兽共患病与比较医学实验室保存；猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪伪狂犬病毒(PrV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)的灭活抗原由上海交通大学人兽共患病与比较医学实验室供。
[0024]本专利技术中RNA提取试剂盒E.Z.N.A.Total RNAKit，购自美国Omega公司；RNA恒温快速扩增试剂盒购自潍坊安普未来生物科技有限公司；5
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闪电核酸释放剂和一次性核酸检测试纸条购自南京沃博生物公司；反转录PrimerScript RT reagent Kit试剂盒、T
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Vector载体和DNALigation Kit一步法克隆试剂盒均购自日本TAKARA公司；引物和探针均由上海生工生物股份有限公司合成。
[0025]实施例1
[0026]1.引物和探针
[0027]根据GenBank中公布的PEDV CV777毒株、CH/SX/2015毒株和JX2020毒株的序列，设计4对引物，序列如表1所示。
[0028]表1引物和探针序列
[0029][0030]通过交叉组合试验筛选最适引物和最佳反应时间及温度，具体方法为：以PEDV感染细胞提取的RNA作为阳性样本，配置50μL的反应体系：重组酶200ng/μL、恒温聚合酶80ng/μL、单链结合蛋白190ng/μL、辅助蛋白60ng/μl、核酸外切酶70ng/μL、dNTPs 0.2mM、聚乙二醇2％、Tris
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HCI 20mM、醋酸镁280mM，上、下游引物(10μmol/L)各2μL，模板2.0μL，DEPC水补齐50μL，混合均匀后转移至含有冻干酶粉的反应管中，震荡混匀后在恒温条件下反应数分钟后，对扩增产物进行凝胶电泳。每对引物分别在20℃、35℃、37℃、42℃，15min、20min、25min、30min的交叉条件下本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于猪流行性腹泻病毒检测的引物及探针，其特征在于，上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。2.用于猪流行性腹泻病毒检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物及探针。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括重组酶、恒温聚合酶、单链结合蛋白、辅助蛋白、核酸外切酶、dNTPs、聚乙二醇、Tris
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HCI和醋酸镁。4.如权利要求1所述的引物及探针或权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨志彪，廖卓韵，周洁文，蒋霁捷，李晨，袁聪俐，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：