一种程序性复苏细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种程序性复苏细胞的方法，属于生物技术领域。该方法包括：将冻存的待复苏细胞例如PBMC细胞或MSC细胞从液氮罐中取出，迅速放入65℃的恒温金属浴，计时100s，迅速转移至37℃的恒温金属浴，计时50s，复苏完成。本发明专利技术采用恒温金属浴替代传统的水浴作为复苏细胞的媒介复苏冻存的细胞，无须不时摇动细胞冻存管，操作简单便捷，且经实验证明复苏后细胞存活率及细胞增殖能力不受影响，有效避免水浴复苏细胞存在水浴锅内的水进入细胞冻存管污染细胞的风险。管污染细胞的风险。管污染细胞的风险。

【技术实现步骤摘要】
一种程序性复苏细胞的方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种程序性复苏细胞的方法。

技术介绍

[0002]间充质干细胞(MSC)在临床上广泛应用，与造血干细胞联合应用，可以提高移植的成功率，加速造血重建。当患者接受大剂量化疗后，将间充质干细胞与造血干细胞一同输入，可明显加速患者血细胞恢复时间，且安全无不良反应。免疫细胞可以保护身体免受病毒、细菌和寄生虫的感染和异物侵扰，并且能够消灭肿瘤细胞，目前干细胞和免疫细胞存储逐渐被人们所认可，存储细胞应用时不可避免涉及到细胞复苏的问题。
[0003]细胞冻存及复苏的基本原理是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力，快速融化可以保证细胞外结晶在很短的时间内融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成结晶对细胞造成伤害。但是，现阶段复苏细胞时普遍采用水浴锅在37℃下进行复苏细胞，即将含细胞的冻存管置于水浴锅内，手动摇晃，使冻存的细胞尽快融化，此方法存在细胞复苏时水浴锅内的水进入细胞冻存管污染细胞的风险。
[0004]基于此，本专利技术提出一种非水浴的程序性复苏细胞的方法。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中的不足，本专利技术的目的是提供一种程序性复苏细胞的方法，操作简便，且细胞存活率不受影响，避免水浴复苏细胞存在水浴锅内的水进入细胞冻存管污染细胞的风险。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]本专利技术提供一种程序性复苏细胞的方法，包括以下步骤：
[0008]步骤1：将冻存的待复苏细胞从液氮罐中取出，迅速放入65℃的恒温金属浴，计时100s；
[0009]步骤2：迅速转移至37℃的恒温金属浴，计时50s，复苏完成。
[0010]作为优选，步骤2中，复苏完成前，冻存管内残留有冰晶，5
‑
15s后冰晶完全溶解。
[0011]作为优选，所述冻存的待复苏细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和间充质干细胞(MSC)。
[0012]作为更优选，所述PBMC细胞来源于人外周血，以细胞悬液的形式冻存，其中细胞密度为0.1
×
107‑
10
×
107个/mL，优选为4
×
107个/mL。
[0013]本专利技术还提供所述程序性复苏细胞的方法在制备生物制品中的应用，细胞包括PBMC细胞和MSC细胞。
[0014]与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
[0015]本专利技术采用恒温金属浴替代传统的水浴作为复苏细胞的媒介复苏冻存的细胞，无须不时摇动细胞冻存管，操作简单便捷，且经实验证明复苏后细胞存活率及细胞增殖能力不受影响，避免水浴复苏细胞存在水浴锅内的水进入细胞冻存管污染细胞的风险。
附图说明
[0016]图1为实施例1中复苏培养PBMC细胞存活率比对结果。
[0017]图2为实施例2中复苏培养MSC细胞数量比对结果。
具体实施方式
[0018]为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施例的附图，对本专利技术实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本专利技术的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0019]以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规化试剂厂商购买得到。
[0020]以下实施例中实验环境、实验材料和仪器设备如下；
[0021]实验环境：GMP环境下实验室内的超净工作台中操作。
[0022]耗材：2.0mL冻存管(Corning)、计数板(Countstar)、T75细胞培养瓶(Corning)、移液管10mL(Corning)。
[0023]试剂：Serum
‑
Free细胞冻存液(Applied Cell)、ALyS505N
‑
0培养基(珠海贝索)、磷酸盐缓冲液(达科为)、胎牛血清FBS(达科为)、IL
‑
2(江苏金丝利)、人间充质干细胞培养试剂盒A型(达科为)、TrypLE
TM
Express酶(1
×
)无酚红(Thermo Fisher)。
[0024]仪器与设备：低速离心机(Thermo Fisher)、CO2培养箱(Thermo Fisher)、超净工作台(Thermo Fisher)、细胞计数仪(Countstar)。
[0025]以下实施例中使用的程序性复苏细胞的方法，包括：待复苏细胞从液氮罐中取出，迅速放入65℃的恒温金属浴，计时100s；迅速转移至37℃的恒温金属浴，计时50s，即复苏完成。
[0026]实施例1
[0027]本实施例进行PBMC细胞存活率测量及对照实验，步骤如下：
[0028]采集健康志愿者人外周血，分离外周血单个核细胞，同时间点取出细胞样品，进行程序性复苏PBMC细胞，并计算细胞存活率。
[0029](1)PBMC分离
[0030]1)将30mL血液缓慢加到淋巴分离管内。
[0031]2)室温下，800
×
g离心20min，慢升慢降。
[0032]3)离心后，血液被分为4层，由血浆(上层)、血浆和分离液之间的单个核细胞层(第2层)、分离液(第3层)和红细胞层(底层)构成。
[0033]4)用移液管缓慢吸取上层的血浆，请勿误吸单个核细胞层，用巴氏吸管将第2层单个核细胞收集至新的离心管。
[0034]5)加入30mL磷酸盐缓冲液稀释细胞悬液，500
×
g离心10min，混匀，取100uL悬液细胞计数，余下悬液600
×
g离心10min。
[0035](2)PBMC冻存
[0036]1)加入Serum
‑
Free细胞冻存液，将细胞密度调整为4.0
×
107个/mL，吹打混匀。
[0037]2)用吸管吸出1mL细胞悬液转移至2mL冻存管，标记好PBMC细胞名称、数量、日期。
[0038]3)将冻存管放置于4℃冰箱30分钟后，转移到
‑
80℃冰箱中过夜，第二天转入液氮罐中保存。
[0039](3)PBMC复苏
[0040]上述PBMC细胞冻存三个月后，将冻存细胞取出进行复苏培养比对。
[0041]实验组：
[0042]1)将细胞从液氮罐中取出，快速放入65℃的恒温金属浴中计时，到达100s时快速转移至37℃的恒温金属浴中计时50s，此时冻存管残留少许冰晶，约10s冰晶完全溶解。
[0043]2)取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加15mL ALyS505N
‑
0培养基到离心管，混匀。
[0044]3)室温本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种程序性复苏细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：将冻存的待复苏细胞从液氮罐中取出，迅速放入65℃的恒温金属浴，计时100s；步骤2：迅速转移至37℃的恒温金属浴，计时50s，复苏完成。2.根据权利要求1所述程序性复苏细胞的方法，其特征在于，步骤2中，复苏完成前，冻存管内残留有冰晶，5
‑
15s后冰晶完全溶解。3.根据权利要求1所述程序性复苏细胞的方法，其特征在于，所述冻存的待复苏细胞包括PBMC细胞和MSC细胞。4.根据权利要求3所述程序性复苏细胞的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：张良超，姬广超，周鑫磊，宋航飞，王坪，苏苗苗，
申请(专利权)人：上海安库生医生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：