一种黄鳍鲷脾脏细胞系及其构建方法与应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，公开了一种黄鳍鲷脾脏细胞系及其构建方法与应用。该黄鳍鲷脾脏细胞系于2023年3月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:C202352，目前已传至第40代，该细胞系生长迅速，细胞活力高，传代后可在数天内完成实验要求所需的细胞密度，其攻毒试验结果显示，该黄鳍鲷脾脏细胞系对鳜蛙病毒具有优异的敏感性，可以作为病毒扩繁和功能研究的细胞材料。繁和功能研究的细胞材料。繁和功能研究的细胞材料。

【技术实现步骤摘要】
一种黄鳍鲷脾脏细胞系及其构建方法与应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种黄鳍鲷脾脏细胞系及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]黄鳍鲷(Acanthopagrus latus)，俗称黄脚立，属鲈形目，鲷科，棘鲷属鱼类，在中国广东省沿岸分布较为普遍，为广东珠海的经济海水鱼类，也是我国重要的经济鱼类之一。作为一种浅海暖水性底层鱼类，黄鳍鲷能够适应盐度的剧变，可以在不同的盐度水体中正常生长。随着黄鳍鲷养殖业的发展迅速，细菌性和病毒性等疾病也频繁爆发，造成了养殖业上严重的经济损失，给黄鳍鲷产业发展带来了挑战与阻碍。
[0003]相关技术中，开展活体实验细胞系是用于研究鱼类免疫学和毒理学的有力工具，也是用于相关病毒分离鉴定、疫苗研制的必要材料。鱼类原代细胞系的建立技术已经逐渐成熟，但对于不同物种乃至不同的组织，其细胞分离方法、培养条件均有差异，需要不断地摸索与修正。目前，建立的黄鳍鲷细胞系较少，黄鳍鲷脾脏细胞系建立目前还未见报道。
[0004]因此，有必要建立一种黄鳍鲷脾脏细胞系及其构建方法，为黄鳍鲷病毒病与基因功能的研究提供良好的实验材料。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出了一种黄鳍鲷脾脏细胞系及其构建方法与应用，该黄鳍鲷脾脏细胞系生长迅速，细胞活力高，传代后可在数天内完成实验要求所需的细胞密度，且对鳜蛙病毒具有优异的敏感性。
[0006]本专利技术还提出了一种黄鳍鲷脾脏细胞系的构建方法。/>[0007]本专利技术还提出了一种黄鳍鲷脾脏细胞系在(1)～(3)中任一项中的应用；
[0008](1)培养鳜蛙病毒；
[0009](2)非诊断治疗目的地检测鳜蛙病毒；
[0010](3)用于黄鳍鲷基因功能研究。
[0011]本专利技术还提出了一种黄鳍鲷脾脏细胞系在制备鳜蛙病毒疫苗中的应用。
[0012]本专利技术的第一方面，提供了一种黄鳍鲷脾脏细胞系，其于2023年3月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C202352。
[0013]根据本专利技术实施例的黄鳍鲷脾脏细胞系，至少具有如下有益效果：本专利技术的黄鳍鲷脾脏细胞系生长迅速，细胞活力高，传代后可在数天内完成实验要求所需的细胞密度，且对鳜蛙病毒具有优异的敏感性，相对于常规途径获得的黄鳍鲷脾脏细胞系效果更佳。
[0014]本专利技术的第二方面，提供了一种黄鳍鲷脾脏细胞系的构建方法，包括以下步骤：
[0015]步骤S1、将鱼脾脏组织依次置于乙醇溶液和PBS溶液中浸泡，然后剪成小于2mm3的组织块；
[0016]步骤S2、将所述组织块置于第一培养基中培养，得到原代脾脏细胞，待所述原代脾
脏细胞培养至密度为70％～80％后，去除所述第一培养基，然后加入消化液进行消化，固液分离，并收集细胞沉淀，得到传代黄鳍鲷脾脏细胞系，并用第一培养基进行传代培养；
[0017]步骤S3、传代培养至第8～10代，用第二培养基进行培养，传代培养至第18～20代，用第三培养基进行培养，即得所述黄鳍鲷脾脏细胞系。
[0018]根据本专利技术实施例的构建方法，至少具有如下有益效果：本专利技术的黄鳍鲷脾脏细胞系构建方法简单，通过逐步驯化过程获得的黄鳍鲷脾脏细胞系对鳜蛙病毒具有优异的敏感性。
[0019]在本专利技术的一些实施方式中，所述乙醇溶液为质量分数为70％～80％的乙醇水溶液；
[0020]优选地，所述乙醇溶液为质量分数为75％的乙醇水溶液。
[0021]在本专利技术的一些实施方式中，所述消化液中蛋白酶为胰酶。
[0022]在本专利技术的一些实施方式中，所述消化液中蛋白酶体积分数为0.2％～0.3％；
[0023]优选地，所述消化液中蛋白酶体积分数为0.25％。
[0024]在本专利技术的一些实施方式中，所述第一培养基为含有青霉素、链霉素、硫酸软骨素、碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor,bFGF)、胰岛素样生长因子(Insulin
‑
like growth factors
‑
1,IGF
‑
1)和胎牛血清的DMEM/F
‑
12培养基，其中所述胎牛血清的体积分数为18％～22％；
[0025]优选地，所述第一培养基为含有100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素、20μg/mL硫酸软骨素、5ng/mL bFGF、40ng/mL IGF
‑
1和20％胎牛血清的DMEM/F
‑
12培养基。
[0026]在本专利技术的一些实施方式中，所述第二培养基为含有青霉素、链霉素、硫酸软骨素、bFGF、IGF
‑
1和胎牛血清的DMEM/F
‑
12培养基，其中所述胎牛血清的体积分数为8％～12％；
[0027]优选地，所述第二培养基为含有100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素、20μg/mL硫酸软骨素、5ng/mL bFGF、40ng/mL IGF
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1和10％胎牛血清的DMEM/F
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12培养基。
[0028]在本专利技术的一些实施方式中，所述第三培养基为含有8％～10％胎牛血清的DMEM/F
‑
12培养基；
[0029]优选地，所述第三培养基为仅含有8％～10％胎牛血清的DMEM/F
‑
12培养基。
[0030]在本专利技术的一些实施方式中，所述DMEM/F
‑
12培养基中DMEM培养基与F
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12培养基的体积比为1:0.8～1.2；
[0031]优选地，所述DMEM/F
‑
12培养基中DMEM培养基与F
‑
12培养基的体积比为1：1。
[0032]在本专利技术的一些实施方式中，所述培养的温度为28
±
2℃，CO2的体积分数为4％～6％。
[0033]优选地，所述培养的温度为28℃，CO2的体积分数为5％。
[0034]本专利技术的第三方面，提供一种上述黄鳍鲷脾脏细胞系在(1)～(3)中任一项中的应用；
[0035](1)培养鳜蛙病毒；
[0036](2)非诊断治疗目的地检测鳜蛙病毒；
[0037](3)用于黄鳍鲷基因功能研究。
[0038]根据本专利技术实施例的应用，至少具有如下有益效果：
[0039]本专利技术的黄鳍鲷脾脏细胞系对鳜蛙病毒具有优异的敏感性，其中在鳜蛙病毒攻毒7天后出现明显的病变细胞(细胞形态趋于圆形，发生皱缩，折光性增加)，且病变细胞数量随天数增长，攻毒9天后发生明显病变死亡，而无攻毒对照组细胞形态无明显改变。
[0040]本专利技术的第四方面，提供一种上述的黄鳍鲷脾脏细胞系在制备鳜蛙病毒疫苗中的应用。
[0041]本专利技术的其它特征和优点将本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种黄鳍鲷脾脏细胞系，其于2023年3月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C202352。2.一种如权利要求1所述的黄鳍鲷脾脏细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤S1、将鱼脾脏组织依次置于乙醇溶液和PBS溶液中浸泡，然后剪成小于2mm3的组织块；步骤S2、将所述组织块置于第一培养基中培养，得到原代脾脏细胞，待所述原代脾脏细胞培养至密度为70％～80％后，去除所述第一培养基，然后加入消化液进行消化，固液分离，并收集细胞沉淀，得到传代黄鳍鲷脾脏细胞系，并用第一培养基进行传代培养；步骤S3、传代培养至第8～10代，用第二培养基进行培养，传代培养至第18～20代，用第三培养基进行培养，即得所述黄鳍鲷脾脏细胞系。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述消化液中蛋白酶体积分数为0.2％～0.3％。4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述第一培养基为含有青霉素、链霉素、硫酸软骨素、bFGF、IGF
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1和胎牛血清的DMEM/F
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12培养基，其中所述胎牛血清的体积分数为1...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭长军，詹志鹏，符家杰，翁少萍，何建国，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：