登革病毒的PCR检测方法技术

本发明专利技术公开了一种登革病毒的PCR检测方法，首先从待检测样本中提取登革病毒基因组RNA并纯化，然后基于登革病毒的四种病毒毒株的5

【技术实现步骤摘要】
登革病毒的PCR检测方法


[0001]本专利技术基因检测
，特别涉及一种登革病毒的PCR检测方法


技术介绍

[0002]登革热(dengue fever，DF)是由伊蚊(Aedes)传播的、登革病毒(denguevirus,DENV)感染引起的人类最严重的虫媒传染病，可引起登革热(DF)、重症登革热和登革休克综合征等。尤其是以高热、严重出血、休克等为临床症状的重症登革热，病死率较高。
[0003]由于全球气候变暖、人口快速增长、人员流动性激增等因素，登革病毒感染的威胁正日趋严重，近几十年全球登革热发病率大幅度增长。据预测，全球50
‑
60％的人口可能会面临威胁，登革病毒感染已成为一个世界性的严重公共卫生问题，是世界卫生组织呼吁全球预警和应对 (Global Alert and Response，GAR)的疾病之一。
[0004][0005]登革病毒以伊蚊为传播媒介，共有四种不同血清型毒株。目前认为：病毒的传播途径是由雌蚊叮咬带有病毒血症的登革热患者或灵长类动物宿主，病毒在蚊虫体内增殖8～10天后，再将病毒传播给健康人，伊蚊宿主感染后无症状，但可终身携带和传播病毒，并可经卵传递给后代。由此可见：伊蚊在登革病毒的传播链条中处于中心的位置。所以，针对伊蚊感染登革病毒进行检测将在极早期获得疾病传播的信息，将成为控制登革病毒在人群中传播的极早期监控手段。
[0006]长期以来，在蚊虫感染登革病毒的极早期，病毒的滴度非常低，需要灵敏度高、特异性强的检测方法。登革病毒传播的极早期方法非常欠缺，对登革病毒的检测常常是疫情发生之后，即出现人群感染病例后检测，使得对登革病毒的检测常常处于被动和滞后的状态，常用的检测方法为：ELISA方法检测病人血清中特异性的登革病毒抗体和登革病毒抗原；PCR方法检测登革病毒的基因序列。而由于灵敏度、特异性问题，对于蚊虫感染登革病毒的检测方法相对欠缺，仅仅在人感染的流行区域对蚊虫进行登革病毒基因PCR检测，检测主要针对登革病毒的结构基因——E(envelop)基因，灵敏度不高，无法用于登革病毒疫情极早期的预警检测，也不能将四种病毒毒株一次性检出。

技术实现思路

[0007]本专利技术的主要目的是提出一种登革病毒检测方法，旨在解决现有技术中无法在登革疫情发生极早期进行检测，从而进行预警监控，避免大范围流行的技术问题。
[0008]为实现上述目的，本专利技术提出一种登革病毒的PCR检测方法，所述登革病毒的PCR检测方法包括以下步骤：
[0009]1)从待检测样本中提取登革病毒基因组RNA并纯化，获得登革病毒基因组样本；
[0010]2)基于登革病毒的四种病毒毒株的5
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UTR共有一致性序列，设计用于逆转录的特异性环状引物，并根据所述特异性环状引物构建特异性逆转录环状引物，其中，所述登革病毒的四种病毒毒株包括登革病毒1型毒株、登革病毒2型毒株、登革病毒3型毒株和登革病毒
4型毒株；
[0011]3)利用所述特异性逆转录环状引物对所述登革病毒基因组样本进行逆转录，获得登革病毒的cDNA；
[0012]4)对所述登革病毒的cDNA进行定量检测，以得出登革病毒的浓度值，并根据所述浓度值判断待检测样品是否感染登革病毒。
[0013]可选地，所述待检测样本包括血液、细胞和组织标本中的至少一种；
[0014]从待检测样本中提取登革病毒基因组RNA的步骤包括：直接利用Trizol试剂匀浆破碎待检测样本，提取全部RNA分子。
[0015]可选地，所述登革病毒的四种病毒毒株的5
’‑
UTR共有一致性序列如SEQIDNO：1所示。
[0016]可选地，所述特异性环状引物的序列如SEQIDNO：2所示。
[0017]可选地，所述特异性逆转录环状引物的序列如SEQIDNO：3所示。
[0018]可选地，利用所述特异性逆转录环状引物对所述登革病毒基因组样本进行逆转录，获得登革病毒的cDNA的步骤中：所述特异性逆转录环状引物在逆转录酶的作用下，通过特异性碱基与登革病毒5
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UTR一致性序列互补配对，获得逆转录产物cDNA。
[0019]可选地，利用所述特异性逆转录环状引物对所述登革病毒基因组样本进行逆转录，获得登革病毒的cDNA的步骤包括：
[0020]1)根据iScriptTMcDNASynthesiskit将RNA逆转录成cDNA，所有操作均在4℃冰浴上进行，取RNA样品1μg，5
′‑
UTRRTLprimer1μl加适量DEPC水形成总体积为12μl的混合物；
[0021]2)将所述混合物置于PCR仪上，65℃反应5min，置于冰上2
‑
3min；
[0022]3)向上述混合物中分别加入10mMdNTPMix2μl，RiboLockRNaseInhibitor1μl，5
×
ReactionBuffer4μl，RevertAidTMM
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MuLVReverseTranscriptase1μl，总体系20μL，充分混匀；
[0023]4)上述反应体系置于PCR仪上反应42℃，60min，然后70℃温育5min，即获得包含登革病毒四种毒株的特征性cDNA片段。
[0024]可选地，对所述登革病毒的cDNA进行定量检测，以得出登革病毒的浓度值的步骤中，所述定量检测通过荧光定量PCR检测方法进行，所述荧光定量PCR检测方法包括以下步骤：
[0025]1)确定正反向特异PCR引物序列，其中
[0026]所述正向引物的序列如SEQIDNO：4所示；
[0027]所述反向引物的序列如SEQIDNO：5所示；
[0028]2)确定荧光定量PCR反应体系及反应循环程序；
[0029]3)以18S为内参基因，利用所述反应体系和反应循环程序，进行荧光定量PCR的测定及结果判定。
[0030]可选地，根据权利要求8所述的登革病毒的PCR检测方法，
[0031]所述反应体系为：RealMastermix(2x)，10μl；正向引物，0.4μl；反向引物，0.4μl；cDNA，1μl；纯水，8.2μl；总体积，20μl；
[0032]所述反应循环程序为：95℃预变性2min；95℃变性15s；50℃退火/延伸40s；共40
个循环。
[0033]可选地，根据所述Ct值判断待检测样品是否感染登革病毒的步骤，包括：
[0034]1)所述Ct值与预设Ct阈值进行比较；
[0035]2)对比较结果进行判定：
[0036]当所述样本的登革病毒Ct值低于预设Ct阈值时，判定所述待检测样本感染登革病毒；
[0037]当所述样本的登革病毒Ct值大于或等于设定Ct阈值时，判定所述待检测样本未感染登革病毒；
[0038]3)根据判定结果输出判定结论；
[003本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种登革病毒的PCR检测方法，其特征在于，所述登革病毒的PCR检测方法包括以下步骤：1)从待检测样本中提取登革病毒基因组RNA并纯化，获得登革病毒基因组样本；2)基于登革病毒的四种病毒毒株的5
’‑
UTR共有一致性序列，设计用于逆转录的特异性环状引物，并根据所述特异性环状引物构建特异性逆转录引物，其中，所述登革病毒的四种病毒毒株包括登革病毒1型毒株、登革病毒2型毒株、登革病毒3型毒株和登革病毒4型毒株；3)利用所述特异性逆转录环状引物对所述登革病毒基因组样本进行逆转录，获得登革病毒的cDNA；4)对所述登革病毒的cDNA再进行荧光定量PCR检测，以得出登革病毒的Ct值，并根据所述Ct值判断待检测样品是否感染登革病毒。2.如权利要求1所述的登革病毒的PCR检测方法，其特征在于，所述待检测样本包括血液、细胞和组织标本中的至少一种；从待检测样本中提取登革病毒基因组RNA的步骤包括：直接利用Trizol试剂匀浆破碎待检测样本，提取全部RNA分子。3.如权利要求1所述的登革病毒的PCR检测方法，其特征在于，所述登革病毒的四种病毒毒株的5
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UTR共有一致性序列如SEQ ID NO：1所示。4.如权利要求1所述的登革病毒的PCR检测方法，其特征在于，所述特异性环状引物的序列如SEQ ID NO：2所示。5.如权利要求1所述的登革病毒的PCR检测方法，其特征在于，所述特异性逆转录环状引物的序列如SEQ ID NO：3所示。6.如权利要求1所述的登革病毒的PCR检测方法，其特征在于，利用所述特异性逆转录环状引物对所述登革病毒基因组样本进行逆转录，获得登革病毒的cDNA的步骤中：所述特异性逆转录环状引物在逆转录酶的作用下，通过特异性碱基与登革病毒5
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UTR一致性序列互补配对，获得逆转录产物cDNA。7.如权利要求1所述的登革病毒的PCR检测方法，其特征在于，利用所述特异性逆转录环状引物对所述登革病毒基因组样本进行逆转录，获得登革病毒的cDNA的步骤包括：1)根据iScriptTM cDNA Synthesis kit将RNA逆转录成cDNA，所有操作均在4℃冰浴上进行，取RNA样品1μg，5
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【专利技术属性】
技术研发人员：李凌云，代函鹰，周兆平，王晓红，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：