一种RT-qPCR检测百合无症状病毒的方法技术

本发明专利技术公开了一种RT

【技术实现步骤摘要】
一种RT
‑
qPCR检测百合无症状病毒的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种RT
‑
qPCR检测百合无症状病毒的方法。

技术介绍

[0002]龙牙百合(Lilium brownii var.viridulum Baker)是百合科(Liliaceae)百合属(Lilium)多年生草本植物，是野百合(Lilium brownii)的变种，因其鳞片肥大，形似龙牙而得名，具有个体肥厚而抱合紧密、颜色洁白而肉质细嫩、品质优良而营养丰富的优点，深受国内外消费者青睐(隆旺夫，1995)，为我国三大食用百合之一(赵健等，2017)。然而，在栽培过程中，龙牙百合常受到病毒病的侵染，导致其种球减产、花蕾畸形和凋落等，严重影响其产量和品质(徐榕雪，2007)。目前已经发现百合的病毒病原约有14种，其中以百合无症状病毒(Lily Symptomless Virus，LSV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic Virus，CMV)、以及异名百合斑驳病毒(Lily Mottle Virus，LMoV)等3种病毒病是在百合种球生产中最普遍发生、危害严重的病毒(Kwon et al.，2013)。目前防治百合病毒病最有效的方法是利用病毒检测技术结合病毒脱除技术生产脱毒种球，并在生产中实时监测病毒的发生，防止其蔓延。因此，建立高效、快速、灵敏、准确的百合病毒检测技术至关重要。
[0003]目前常见的植物病毒病检测方法有指示植物法、电镜检测法、酶联免疫吸附法和分子生物学方法。
[0004]早期的植物病毒病的检测一般采用传统的生物学方法即指示植物检测法，即通过汁液摩擦接种或嫁接传染方式将待检测带毒植株的汁液接种到一种或几种指示植物上，观察其在指示植物上表现出的症状来进行检测的方法。但当从植物的直观性状表现上无法辨析感染病毒的类别时，就需要借助于显微镜进行更细微层次检测。一般通过对待测组织进行制样，借助负染色技术以及切片技术的应用进行观察，可以观测到病毒引起的寄主细胞的病变和内含体特征，是深度研究病毒病机理的重要手段之一(张伟等，2013)。但仪器设备比较昂贵，制片和操作技术复杂不易掌握，对操作人员技术水平要求较高(刘文洪等，2003)。随着免疫学的发展，建立了病毒检测的酶联免疫吸附法(Enzyme
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linked immunosorbent assay，ELISA)，该方法具有快速、直观、费用较低等优点，逐渐成为病毒检测的主要方法。酶联免疫吸附法将植物病毒作为抗原，注射至动物体内产生抗体。每种病毒产生的抗血清具有特异性识别功能，可根据已知病毒的抗血清检测未知病毒。但纳克级别以下无法检测，且需制备高质量的抗血清，易出现假阴性(王继华等，2004)。此外，因抗原抗体反应具有专一性，但不同百合植株中病毒抗原会有所差异，所以常会漏检某一病毒或某一株系病毒。
[0005]分子生物学技术通过检测病毒遗传物质(RNA、DNA)确定病毒的存在，稳定性、灵敏性更高，适用于几乎所有植物病毒及类病毒的检测。早期的分子生物学病毒检测技术，主要指核酸杂交技术和双链RNA电泳技术，但技术难度较高，随着聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)技术的快速发展，这两种方法逐渐被淘汰，基于PCR技术的病毒检测方法成为当前检测技术的主流。以核酸检测为代表的分子生物学检测技术主要包括PCR技
术、多重PCR技术、荧光定量PCR技术及环介导等温扩增技术(LAMP)。
[0006]PCR是体外模拟体内基因复制的技术，能够在短时间内大量扩增目的DNA片段。其基本过程是：(1)双链DNA经过高温(95℃)变性，解链变成两条单链DNA；(2)单链D NA低温(与引物有关)复性，引物与单链DNA上的目的基因片段的启始位点互补结合；(3)72℃延伸，在引物的引导下和TaqDNA聚合酶的催化下，以目的DNA为模板，合成新的D NA链。逆转录聚合酶链式反应(RT
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PCR)则是在常规PCR基础上运用逆转录酶，将逆转录与基因扩增在一个反应管内进行。而多重PCR技术的基本原理与PCR类似，区别在于同一个反应体系中加入了2对以上的特异性引物，可以同时完成多个目的基因的扩增，这样一个反应体系就可以同时检测多个病毒，从而减少检测成本和时间。由于植物经常发生多种病毒复合侵染的情况，因此多重PCR检测方法在植物病毒检测中应用频繁。
[0007]迄今为止，针对百合感染的3种主要病毒(LSV、CMV、LMoV)的检测开发出了多种检测技术，其中最常用的手段为分子生物学技术，主要包括PCR技术、多重PCR技术和LA MP技术，以上方法虽然可以检测出百合感染的3种病毒，但在检测灵敏度和定量等方面存在劣势。多个研究团队通过优化多重RT
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PCR反应条件，实现了同时快速检测LMoV、CMV和LSV病毒(王冲等，2006；徐榕雪等，2007；邹迎春等，2013；陈进，2013)。Zhao等人从百合斑驳病毒、百合无症病毒、黄瓜花叶病毒的CP基因上寻找保守区域，选择保守区域时避开所有的突变位点设计获得LAMP特异性引物，建立了百合病毒的LAMP和RT
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LAMP检测体系(Zhao et al.，2018，2019)。但多重PCR技术因反应液中存在多对引物对，扩增时引物相互干扰，不同片段扩增效率不同，短片段优先扩增，而且易出现人工片段，出现非特异性扩增，无法判断是否存在假阳性，有时需添加假阳性检测步骤。此外，对于携带微量病毒的植物组织，RT
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PCR方法的检测灵敏度还不能达到要求，另外，PCR产物还需要电泳和接触有毒试剂EB等。而LAMP4条引物只有与靶序列的6个区域完全匹配时，才能进行有效扩增，且低于100bp无法设计引物(杨丹等，2021)。
[0008]实时荧光定量PCR(RT
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qPCR)是PCR技术与荧光技术相结合的一种方法，其原理是将荧光染料或荧光标记的特异性探针加入到PCR反应体系中，根据荧光信号的积累实时监测整个PCR过程。灵敏度和特异性是诊断技术发展非常重要的指标(Torre et al.，2020)。相对于普通PCR和多重PCR，RT
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qPCR特异性、敏感性和重复性更好，由于基因的扩增和检测同时进行，因此可对模板进行定性和定量分析(王森等，2021)，极大节省了检测时间。开发一种采用RT
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qPCR检测百合是否感染LSV病毒的方法是非常必要的。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的是提供一种RT
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qPCR检测百合无症状病毒的方法，以解决上述现有技术存在的问题，本专利技术的方法可以缩短百合无症状病毒检测的时间，同时对低浓度病毒含量的龙牙百合组织样本，具有较好的检出率。
[0010]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0011]本专利技术提供一种RT
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qPCR检测百合无症状病毒的引物对，包本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种RT
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qPCR检测百合无症状病毒的引物对，其特征在于，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的q
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LSV
‑1‑
F引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的q
‑
LSV
‑1‑
R引物。2.一种如权利要求1所述的引物对在制备RT
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qPCR检测百合无症状病毒的试剂盒中的应用。3.一种RT
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qPCR检测百合无症状病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物对。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括内参引物Actin
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F和Actin
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R，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7
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8所示。5.一种如权利要求1所述的引物对或如权利要求3或4所述的试剂盒在RT
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qPCR检测百合无症...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘艳梅，罗雯，陈凯，熊敏，张同林，匡全，邱浩文，曾淑萍，
申请(专利权)人：南昌师范学院，
类型：发明
国别省市：