检测流行性犬瘟热病毒的引物组合物、试剂盒及可视化检测方法技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，具体涉及一种检测流行性犬瘟热病毒的引物组合物、试剂盒及可视化检测方法。本发明专利技术的有益效果在于，本发明专利技术属于基因检测方法，LAMP反应中有4条特异性引物，对靶基因上6个区域进行识别，保证了LAMP反应的高度扩增性、灵敏度和特异性，经测试灵敏度达100％，特异性为100％，同时，与传统PCR相比降低了LAMP扩增的时间，传统PCR鉴定的反应时间一般在60min左右，经测试本发明专利技术中的方法反应试剂可以控制在30min以内。提供的可视化检测方法，特异性和灵敏度高、重复性好，且操作极为简单，反应快，成本低，只需要恒温加热环境非专业人员即可操作，适用于宠物医院、宠物主对宠物犬健康检测等需要快速诊断的应用场景。场景。场景。

【技术实现步骤摘要】
FIP，100
‑
200μM CDV BIP，100
‑
200μM CDV LF，100
‑
200μM CDV LB。
[0014]具体的，还提供一种用于检测流行性犬瘟热病毒的试剂盒，包括：2
×
LAMP Master Mix、搭配该检测引物组合物使用，该2
×
LAMP Master Mix试剂主要包括4～10U/μL的BST3.0酶，1
‑
10μM的dNTPs，以及50
‑
100μM的pH显色指示剂。通过试剂颜色变化即可判断是否有CDV病毒存在，当存在CDV病毒时，试剂由紫红色变为黄色。
[0015]具体的，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照；所述阳性对照为犬瘟热病毒阳性样本；所述阴性对照为超纯水。
[0016]具体的，所述样本包括犬粪便样本、鼻咽拭子样本、分泌物拭子样本。
[0017]具体的，还提供一种用于检测流行性犬瘟热病毒的方法，包括以下步骤：
[0018](1)取少量待测样本，用无菌水稀释100
‑
1000倍；
[0019](2)配制LAMP反应体系；
[0020](3)震荡混匀、离心后，采用恒温加热装置，55
‑
65℃恒温加热25
‑
30min，取出观察试剂颜色。
[0021]具体的，所述LAMP反应体系包括：2
×
LAMP Master Mix、引物组合物混合液、待测样本稀释液。
>[0022]具体的，所述试剂颜色显色为黄色，样本为阳性，显色为紫红色，样本为阴性。
[0023]具体的，所述恒温加热装置包括：水浴锅、金属浴、或恒温烘箱。
[0024]本专利技术的有益效果在于本专利技术属于基因检测方法，LAMP反应中有4条特异性引物，对靶基因上6个区域进行识别，保证了LAMP反应的高度扩增性、灵敏度和特异性，经测试灵敏度达100％，特异性为100％，同时，与传统PCR相比降低了LAMP扩增的时间，传统PCR鉴定的反应时间一般在60min左右，经测试本专利技术中的方法反应试剂可以控制在30min以内。在保留基因检测的灵敏度和特异性的情况下，突破了传统基因鉴定实验的局限性，无需DNA/RNA提取不需要PCR仪和昂贵的试剂，可以只用肉眼观察反应试剂颜色快速完成检验，做到了降本增效的优秀效果。同时，该专利技术涉及的引物针对犬瘟热病毒亚洲1型病毒，提供的这种以用于检测犬瘟热病毒的引物探针组合物作为主要成分的可视化检测方法，耗时短，在25
‑
30min内完成、特异性和灵敏度高、重复性好，且操作极为简单，反应快，成本低，只需要恒温加热环境非专业人员即可操作，适用于宠物医院、宠物主对宠物犬健康检测等需要快速诊断的应用场景。
附图说明
[0025]图1是本专利技术实施例1阴性、阳性样品颜色显示；
[0026]图2是本专利技术实施例3质粒拷贝数(copies/uL)。
具体实施方式
[0027]以下结合实施例对本专利技术作进一步作具体描述，但不局限于此。
[0028]实施例1：
[0029]检测犬瘟热病毒的方法，包括以下步骤：
[0030](1)取少量犬粪便待测样本，用无菌水稀释1000倍；
[0031](2)按照下表，在200μLPCR管中配制LAMP反应体系，
[0032][0033]震荡混匀瞬时离心后，采用恒温加热装置(水浴锅、金属浴、或恒温烘箱)65℃恒温加热25
‑
30min，取出观察试剂颜色即可。
[0034]试剂初始为紫红色并与检测样本混合，加热反应后阳性样本变为黄色，阴性样本保存紫红色不变，如图1中所示。
[0035]实施例2：
[0036]测试该试剂盒灵敏度和特异性的方法如下：
[0037](1)将已知阴阳性的宠物犬粪便样本分为3批保存，每批样本中阴性和阳性样本各十个。
[0038](2)开始试剂盒的灵敏度和特异性测试：每隔两天取出一批样本，通过实施例1的方法进行LAMP反应，统计反应结果是否与已知结果一致。
[0039]灵敏度＝测试阳性结果数目/已知阳性样本数目
[0040]特异性＝测试阴性结果数目/已知阴性样本数目
[0041][0042]实施例3
[0043]测试该试剂盒的检出限方法如下：
[0044](1)与上海生工生物公司订购合成附表中犬瘟热病毒Asia
‑
1亚型"nucleocapsid protein N"基因序列(NCBI ACCESSION:MK431532)DNA序列并构建与pub57通用载体中，得到4μg质粒。
[0045](2)计算质粒拷贝数：
[0046](6.02
×
10
23
次拷贝数/摩尔)
×
(ng/ul
×
10
‑9)/(DNA长度
×
660)＝copies/μL。
[0047](3)按照计算出的拷贝数，将质粒干粉稀释，得到将1000copy/μL的CDV质粒溶液
[0048](4)按照2倍浓度梯度进行梯度稀释，得到500copy/μL、250copy/μL、125copy/μL、
[0049]62.5copy/μL的质粒溶液。
[0050](5)分别取5μL上述样本按实施例1进行LAMP反应，反应体系12.5μL。阳性反应体系中的质粒终浓度分别为200copies/μL，100copies/μL，50copies/μL，25copies/μL。以无菌水作为阴性对照记为0copies/μL。
[0051](6)以上一步的质粒稀释液为样本，按照实施例1中的方法进行LAMP反应，每组重复10个样本。
[0052]实验结果如图2所示，实验结果表明，该试剂盒CDV LAMP反应的检出限C
50
值应为50copy/μL。高于市面同类产品100
‑
200copy/μL的C
50
值。该实验证明本专利技术方法的高效性。
[0053]以上所述的仅是本专利技术的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员
来说，在不脱离本专利技术创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本专利技术的保护范围。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测流行性犬瘟热病毒的引物组合物，其特征在于，包括：CDV F3其序列为：ATTCAAGCATTGTTACAAGGTCDV B3其序列为：TGTAAGACCACAAACAGAGTCDV FIP其序列为：ACGAACAAGGAGAGGATACTGATTATTTTGACTTGTTAGATTGGTCGGTCDV BIP其序列为：TCCCCTGGACAGTTGATCCATTTTTGATGCTTGGGATTACCTC CDV LF其序列为：GGTCCGTTGATTTCCGGATCCDV LB其序列为：GAGGATCATAGACGACCCTGATGT。2.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包含10
‑
50μM CDV F3，10
‑
50μM CDV B3，100
‑
200μM CDV FIP，100
‑
200μM CDV BIP，100
‑
200μM CDV LF，100
‑
200μM CDV LB。3.一种用于检测流行性犬瘟热病毒的试剂盒，其特征在于，包括：2
×
LAMP Master Mix、权利要求1
‑
2任一项所述的引物组合物。4.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：关国良，陈巧玲，李琦，贾瑶瑶，
申请(专利权)人：常州先趋医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：