一种检测牛巴泰病毒的环介导等温扩增引物组及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种牛巴泰病毒环介导等温扩增检测引物组及试剂盒。本发明专利技术通过比对Genbank中牛巴泰病毒的所有序列，在其相对保守的M基因设计LAMP引物，经筛选后得到一组用于牛巴泰病毒检测的LAMP引物组合物。同时，在上述LAMP引物组合物的基础上，建立了一种LAMP试剂盒，并以该试剂盒建立了一种快速、灵敏、准确性高、重复性强的牛巴泰病毒的检测方法。经特异性、灵敏性、重复性和稳定性试验发现，该方法的特异性高，不与其他病毒交叉反应，且最低检测限度可达到2.86copies/μL，重复性和稳定性均较好，可以实现牛巴泰病毒的快速、即时检测。在牛巴泰病毒得以控制之后将显著提高牛胚胎成活率，降低牛的死亡率，提高养牛业的经济效益。效益。效益。

【技术实现步骤摘要】
一种检测牛巴泰病毒的环介导等温扩增引物组及试剂盒


[0001]本专利技术涉及一种检测牛巴泰病毒的环介导等温扩增引物组及试剂盒，属于病毒的检测或诊断


技术介绍

[0002]巴泰病毒是布尼亚病毒目（Bunyavirales）泛布尼亚病毒科（Peribunyaviridae）正布尼亚病毒属（Orthobunyavirus）布尼亚姆韦拉(Bunyamwera)血清组的成员，最初于1955年从马来西亚的库蚊中分离出来。血清学监测和病毒分离表明，牛巴泰病毒（Batai virus，BATV）在世界范围内分布广泛。与其他几种布尼亚病毒一样，BATV是一种能在人类中引起发热性疾病的病原体，并与反刍动物的流产、早产和先天性缺陷的高发病率有关。 BATV 在自然界中以“蚊虫
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脊椎动物
‑
蚊虫”的方式循环，感染宿主的范围也在不断扩大，为了有效应对可能出现的疫情，及时建立并储备多种 BATV 检测方法对于突发疫情的防控具有十分重要的意义。
[0003]BATV NM/12是最近从我国牛体内分离到的BATV毒株。BATV基因组由三个负极性的单链RNA片段组成，分别命名为S（小）、M（中）和L（大）。S RNA片段编码核衣壳蛋白(N)和非结构蛋白(NS
S
)。M片段编码一个糖蛋白前体，被宿主蛋白酶切割成一个非结构蛋白(NSm)和两个病毒粒子表面糖蛋白Gn和G
C
。L片段编码依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp)。在混合感染期间，布尼亚病毒物种可以通过重组这些基因组片段来增加它们的遗传多样性。
[0004]BATV的M片段和来自Bunyamwera病毒的S和L片段基因重配产生了Ngari病毒。早期发现和诊断可能有助于降低BATV的传播并将与疾病相关的经济损失降至最低。到目前为止，常用的诊断方法包括病毒分离和基于基因扩增的分子技术如逆转录聚合酶链反应(RT
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PCR)。对BATV的分布和流行情况的研究很少。虽然常规RT
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PCR是对感染宿主组织和体液样本进行病毒诊断的首选方法，但在BATV传播盛行的农村地区，缺乏RT
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PCR设备和技术支持。此外，BATV感染宿主血液中病毒RNA拷贝数低也限制了基于RT
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PCR的BATV检测。
[0005]逆转录环介导的等温扩增(RT
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LAMP)是一种较新的核酸扩增方法，能在等温条件下扩增DNA，具有快速、高效、特异性强等特点。这种方法依赖于Bst DNA聚合酶大片段进行的自动循环链置换DNA合成。LAMP方法最大的优点是能够在60
‑
65℃的恒温条件下，在1h或更短的时间内扩增出特异性和灵敏度高的特异性靶DNA序列，而且不需要热循环仪或专门的实验室设施。本方法的较高扩增效率使得仅使用插入染料（如紫外光照射的SYBR Green I或琼脂糖凝胶电泳后的数字成像）就可以简单地观察到扩增。
[0006]综上所述，利用LAMP检测方法能建立起特异、稳定，灵敏、高效的技术检测体系，在牛巴泰病毒的检测方面具有重要的应用价值。有望在牛巴泰病毒得以控制之后显著提高牛胚胎成活率，降低牛的死亡率，提高养牛业的经济效益。

技术实现思路

[0007]为了克服现有技术的不足，本专利技术首要目的是提供一种用于检测牛巴泰病毒的环
介导等温扩增引物组；本专利技术的第二个目的是提供一种基于检测牛巴泰病毒的环介导等温扩增试剂盒；本专利技术的第三个目的是提供上述引物组以及环介导等温扩增试剂盒在检测或诊断牛巴泰病毒感染中的应用。
[0008]为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：本专利技术从Genbank数据库中检索并获得所有牛巴泰病毒的全长基因组序列，通过BLAST软件进行同源性分析，找到牛巴泰病毒基因组相对保守的靶基因（M基因）序列，根据M基因序列，利用Primer Explorer V5软件设计出用于牛巴泰病毒检测的LAMP引物，经筛选后得到1对所需的特异、灵敏的引物组合物，有望为牛巴泰病毒的检测提供一种针对LAMP扩增技术的即时检测方法。
[0009]本专利技术的一种牛巴泰病毒(Batai virus，BATV)环介导等温扩增检测引物组，所述的引物组由1对外引物F3和B3以及1对内引物FIP和BIP组成，所述的引物序列如下：F3：5'
ꢀ‑ꢀ
CATCTCCTTGGAGATCTGC
ꢀ‑
3'，B3：5'
‑ꢀ
TGAAAAATTGTGCAAGGCC
ꢀ‑
3'，FIP：5'
‑
TTGCTTCTATTTCCAAATCTGGGTTTAATGTTGGGAGATCTAAGGT
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3'，BIP：5'
‑ꢀ
TTGGGTGCCCATCATGCTTTA
‑
CTTCAATTGAGCACACAGTA
‑
3'。其中，优选的，所述的外引物和内引物的摩尔比为1：8。
[0010]进一步的，本专利技术还提出了所述引物组在制备牛巴泰病毒检测试剂或产品中的应用。
[0011]更进一步的，本专利技术还提出了一种检测牛巴泰病毒的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含以上所述的引物组。
[0012]其中，优选的，所述的试剂盒还包括：荧光目视检测试剂、10
×
反应缓冲液、BstDNA聚合酶、10 mM dNTP mix、betaine、MgSO4以及超纯水。
[0013]其中，优选的，所述的环介导等温扩增试剂盒用于检测牛巴泰病毒时，LAMP反应体系为25μL，包括: 10
×
反应缓冲液2.5μL，40 pmol FIP和BIP 各1μL，5 pmol F3和B3各1 μL，8 U/μL BstDNA聚合酶1μL，30 mM MgSO
4 5μL，10 mM dNTP mix 2.5μL，5.0 M betaine 1μL，待检样品cDNA模板3μL，其余用超纯水补足至25μL。
[0014]更进一步的，本专利技术还提出了所述的试剂盒在制备检测或诊断牛巴泰病毒试剂中的应用。
[0015]与传统方法相比较，本专利技术的有益效果在于：本专利技术通过比对Genbank中牛巴泰病毒的所有序列，在其相对保守的M基因设计LAMP引物，经筛选后得到一组用于牛巴泰病毒检测的LAMP引物组合物。同时，在上述LAMP引物组合物的基础上，建立一种LAMP扩增技术的试剂盒，并以该试剂盒建立了一种快速、灵敏、准确性高、重复性强的牛巴泰病毒的检测方法。经特异性、灵敏性、重复性和稳定性试验发现，本专利技术提供LAMP技术的检测方法的特异性高，不与其他病毒交叉反应，且最低检测限度可达到2.86copies/μL，重复性和稳定性均较好，可以实现牛巴泰病毒的快速、即时检测，从而解决现有的牛巴泰病毒检测技术耗时、费力、高成本的缺陷，使检测灵敏度和特异性得到提高，降低人工和器材成本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.牛巴泰病毒（Batai virus，BATV）环介导等温扩增检测引物组，其特征在于，所述的引物组由1对外引物F3和B3以及1对内引物FIP和BIP组成，所述的引物序列如下：F3：5'
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CATCTCCTTGGAGATCTGC
ꢀ‑
3'，B3：5'
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TGAAAAATTGTGCAAGGCC
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3'，FIP：5'
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TTGCTTCTATTTCCAAATCTGGGTTTAATGTTGGGAGATCTAAGGT
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3'，BIP：5'
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TTGGGTGCCCATCATGCTTTA
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CTTCAATTGAGCACACAGTA
‑
3'。2.根据权利要求1所述的环介导等温扩增引物组，其特征在于，外引物和内引物的摩尔比为1：8。3.权利要求1或2所述的引物组在制备牛巴泰病毒检测试剂或产品...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘昊，卢梓烁，唐甜，李丽霞，黄誉汉，黄捷，黄良宗，
申请(专利权)人：佛山科学技术学院，
类型：发明
国别省市：