用于检测鸭细小病毒和鸭依赖病毒通用型的引物对及其试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种用于检测鸭细小病毒和鸭依赖病毒通用型的引物对及其试剂盒与检测方法。所述试剂盒包含了四类鸭源细小病毒(MDPV、N

【技术实现步骤摘要】
用于检测鸭细小病毒和鸭依赖病毒通用型的引物对及其试剂盒


[0001]本专利技术属于禽病学领域，具体涉及一种用于检测鸭细小病毒和鸭依赖病毒通用型的引物对及其检测试剂盒。

技术介绍

[0002]国际病毒分类委员会(The International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)的最新分类，细小病毒科(Family:Parvoviridae)下设三个亚科：Densovirinae(浓病毒亚科)、Hamaparvovirinae(中文名待定)和Parvovirinae(细小病毒亚科)。Parvovirinae(细小病毒亚科)下设11个病毒属(genus)。
[0003]鹅细小病毒(Goose parvovirus，GPV)和番鸭细小病毒(Muscovy duckparvovirus，MDPV)是动物病毒中最小的一类单链DNA病毒。临床上以腹泻、渗出性肠炎等为主要临床症状，表现较高的发病率和死亡率，严重危害水禽养殖业的发展。近年来，我国主要水禽养殖区出现导致鹅短喙与侏儒综合征(SBDS)的两类新型水禽细小病毒：导致北京鸭、半番鸭和麻鸭出现SBDS的新型鹅细小病毒(N
‑
GPV)和导致番鸭出现SBDS的基因重组型鸭细小病毒(N
‑
MDPV)。上述四类鸭源细小病毒(MDPV、N
‑
MDPV、GPV和N
‑
GPV)均属于Parvovirinae(细小病毒亚科)Dependoparvovirus(依赖细小病毒属)Dependoparvovirus anseriform1(水禽依赖细小病毒1型病毒种)
[0004]2020年，本研究团队在福建地区鸭群中发现存在鸭源腺相关病毒感染，其VP基因全长(2217bp)和GenBank中的鸭源腺相关病毒MHH
‑
05
‑
2015(GenBank登录号KX583629)的核苷酸同源性为99.5％。鸭腺相关病毒(adeno
‑
associatedvirus，AAV)(也称鸭依赖病毒DAAV)属于细小病毒科(Parvoviridae)依赖病毒属(Dependoparvovirus)Dependoparvovirus avian2种(中文名暂无)，是目前发现的一类结构简单的DNA缺陷型病毒，需要辅助病毒(通常为腺病毒)参与复制。上述研究表明，鸭群中存在5种Parvovirinae(细小病毒亚科)Dependoparvovirus(依赖细小病毒属)：MDPV、N
‑
MDPV、GPV、N
‑
GPV和DAAV，这就给临床鉴别诊断带来现实需求。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种用于检测鸭细小病毒和鸭依赖病毒通用型的引物对及其检测试剂盒，该引物对或试剂盒是针对鸭群中存在5种(MDPV、N
‑
MDPV、GPV、N
‑
GPV和DAAV)属于Parvovirinae(细小病毒亚科)
[0006]Dependoparvovirus(依赖细小病毒属)的通用型检测的引物对及其试剂盒，可以准确快速的判别临床送检病料中是否含有相关病原。
[0007]为实现上述技术方案，采用以下技术方案：
[0008]一种用于检测鸭细小病毒和鸭依赖病毒通用型的引物对，所述引物对为：
[0009]DPAAV
‑
F：5
’‑
CTCRGGAAATTGGCATTGCGATT
‑3’
(SEQ ID NO.1)；
[0010]DPAAV
‑
R：5
’‑
ATYCCCCARTKGTTGTTGAT
‑3’
(SEQ ID NO.2)。
[0011]其中，R＝A/G，Y＝C/T，K＝G/T。
[0012]该引物对可同时对5种病原(MDPV、N
‑
MDPV、GPV、N
‑
GPV和DAAV)进行有效扩增，其中MDPV、N
‑
MDPV、GPV、N
‑
GPV大小为246bp，DAAV大小为237bp，两者常规琼脂糖电泳肉眼无法有效区分。
[0013]鸭细小病毒和鸭依赖病毒通用型检测试剂盒，其包含所述的引物对。
[0014]所述试剂盒的使用方法包括如下：
[0015](1)提供5种病原(MDPV、N
‑
MDPV、GPV、N
‑
GPV和DAAV)阳性对照和阴性对照；
[0016](2)提供通用型的引物对：
[0017]DPAAV
‑
F：5
’‑
CTCRGGAAATTGGCATTGCGATT
‑3’
；
[0018]DPAAV
‑
R：5
’‑
ATYCCCCARTKGTTGTTGAT
‑3’
。
[0019](3)核酸DNA提取：将待检测样品研磨处理后，反复冻融三次，3 000rpm离心20min后，吸取上清200μL，按照病毒核酸提取试剂盒(ViralDNA/RNA Kit)说明书提取核酸DNA。
[0020](4)PCR反应：PCR扩增采用PCR扩增试剂盒(PCR SuperMix(+dye))推荐的50μL进行，其中2
×
EasyTaq PCR SuperMix 25μL，10μmol/L上/下游引物(DPAAV
‑
F和DPAAV
‑
R)各1μL，DNA模板1μL，去离子水22μL，至总体积50μL。反应条件为95℃预变性5min；95℃30s、55℃30s、72℃30s，35个循环；循环结束后72℃延伸5min。
[0021](5)结果判定：对扩增产物进行电泳检测，当待检样品出现约250bp条带，则判为5种病原(MDPV、N
‑
MDPV、GPV、N
‑
GPV和DAAV)感染阳性(具体亚型无法确定)；当待检样品无特异性扩增条带判为阴性。
[0022](6)感染类型判定：如需进一步明确5种病原(MDPV、N
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MDPV、GPV、N
‑
GPV和DAAV)感染阳性样品的具体类型，可将上述PCR扩增产物按照常规方法进行克隆测序，将克隆测序结果进行BLAST分析(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，根据BLAST分析结果即可准备判定感染类型。
[0023]较现有技术而言本专利技术的优点在于：
[0024]一般而言，对5种病原(MDPV、N
‑
MDPV、GPV、N
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GPV和DAAV)进行检测，需要分别设计特异性的引物(每个需要2条，一共需要10条)，经条件优化后组装为检本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测鸭细小病毒和鸭依赖病毒通用型的引物对，其特征在于：所述引物对的序列如下所示：DPAAV
‑
F：5
’‑
CTCRGGAAATTGGCATTGCGATT
‑3’
；DPAA...

【专利技术属性】
技术研发人员：万春和，黄瑜，付环茹，赵敏，
申请(专利权)人：福建省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：