一种用于新型冠状病毒S基因6种突变位点检测的引物探针组合制造技术

本发明专利技术涉及一种用于新型冠状病毒S基因6种突变位点检测的引物及探针组合。本发明专利技术采用ARMS法(扩增受阻突变系统)以新冠S基因为靶序列，设计69

【技术实现步骤摘要】
一种用于新型冠状病毒S基因6种突变位点检测的引物探针组合


[0001]本专利技术属于病毒检测
，具体涉及一种用于新型冠状病毒S基因6种突变位点检测的引物探针组合。

技术介绍

[0002]SARS
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CoV
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2是单股正链RNA病毒，直径60～140nm，具有5个必需基因，分别针对核蛋白(N)、病毒包膜(E)、基质蛋白(M)和刺突蛋白(S)4种结构蛋白及RNA依赖性的RNA聚合酶(RdRp)。S蛋白是重要的结构蛋白，S蛋白上的特定位点的突变，影响病毒与人体细胞的亲和力，改变病毒的传染性和致病性，在病毒传播中起着十分重要的作用。对S基因突变病毒的快速鉴定有助于进一步监控病毒的传播及演化进程。因此，必须建立快速、灵敏的突变基因检测方法才能实现新型冠状病毒S基因突变体的快速有效鉴定。
[0003]WHO提出的VOI是指出现可能或已知影响传染性、疾病严重程度、免疫逃逸、诊断和治疗的特异位点突变的病毒株，在多个国家的相对流行率不断增加，全球公共卫生面临新的风险。VOC是指符合VOI定义，经评估证实存在以下至少一种特点的变异株：
①
病毒传染性增加；
②
致病性增强或临床症状改变；
③
公共卫生及社会措施或诊断、疫苗、治疗方法的有效性降低。目前指定的VOCs有Delta、Omicron变异株，其中Omicron变异株于2021年9月下旬，在南非发现。该突变体有多个刺突蛋白缺失和突变，新冠病毒奥密克戎变异株在病毒刺突(Spike)蛋白突变较多，同时具有前4个变异株Alpha、Beta、Gamma和Delta刺突蛋白的重要氨基酸突变位点，包括增强细胞受体亲和力和病毒复制能力的突变位点，导致其具有极强的传播能力。Alpha(B.1.1.7)变异株共有17个突变，其中S蛋白上有9个突变：Δ69/70、Δ144、N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A、D1118H，另外也可能合并E484K、S494P和K1191N。N501Y的突变是S蛋白RBD第501位氨基酸由天冬氨酸(N)突变为酪氨酸(Y)，该突变不仅改变RBD构象使SARS
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CoV
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2对人体ACE2受体亲和力增加，还可增加病毒粒子与精氨酸
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甘氨酸
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天冬氨酸基序(RGD motif)结合位点的亲和力。Δ69/70影响RBD构象，叠加增强S蛋白对ACE2受体亲和力，增强病毒传染性并有助于病毒发生免疫逃逸，这种缺失也是某些检测试剂盒未能检测到病毒S基因的原因。S蛋白只有被切割，暴露出开放结构区域，才能与人体ACE2受体结合。P681H是S蛋白受体S1和S2区域连接处的弗林蛋白酶切割位点的一部分。该连接处的变化增强了S蛋白上切割位点对蛋白酶的敏感性，能明显提高病毒的传播效率。B.1.351变异株的S蛋白上具备8个突变或位点缺失：D80A、D215G、Δ241/242/243、K417N、E484K、N501Y、D614G和A701V。N501Y及K417N、E484K突变，都可改变RBD构象，增强与ACE2受体亲和力，增加传染性。Gamma(P.1)变异株的S蛋白上存在11个突变，除D614G外，还包括RBD中的K417T、E484K和N501Y；NTD中的L18F、T20N、P26S、D138Y和R190S；和靠近Furin裂解位点的H655Y。研究人员总结了欧洲多个国家COVID
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19病例并分析了B.1.1.7、B.1.351和P.1的临床特点，感染这三种变异株病例的住院率显著高于非VOC病例，入住ICU的可能性分别是非VOC病例的2.3、3.3和2.2倍，并显示在各年龄段有病情加重风险。因此，确定S蛋白的突变
类型，快速识别多种SARS
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CoV
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2变异株，可以防止潜在的广泛感染和变异的流入。
[0004]目前确定突变位点的方法有测序法、荧光PCR法、数字PCR法等。测序技术中包含一代测序即sanger测序技术和新一代测序技术也称为二代测序技术。其中一代测序技术一般一次只能检测一个位点一个样本，检测通量低且耗时长；二代测序技术，检测通量高，可以检测未知突变，但是检测前有复杂的样本处理及测序文库构建过程，检测后有复杂的生物信息学分析过程，整个检测周期较长，难以应对需要快速处理的情况。数字PCR技术作为第三代PCR技术，在传统PCR方法基础上采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，根据泊松分布原理及阴阳性微滴的个数与比例可得出靶分子的起始拷贝数或浓度，进而实现绝对定量。但目前不同数字PCR平台仪器试剂较为昂贵，检测范围窄，无法广泛应用于应急快速诊断。荧光PCR技术相对于测序法和数字PCR技术而言，操作耗时较短，成本较低。普通的荧光PCR技术扩增时加入一对与待扩增序列完全匹配的引物，一条特异性的荧光探针，当需要区分野生型与突变型序列时，则需要与野生型和突变型序列分别匹配的探针，且Taqman探针对于点突变的分辨率不高，MGB探针则价格昂贵。ARMS
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PCR技术建立在等位基因特异性延伸反应基础上，只有当某个等位基因特异性引物的3
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末端碱基与突变位点处碱基互补时，才能进行延伸反应。常规PCR扩增DNA所用的上、下游引物与靶序列完全匹配，而等位基因PCR采用等位基因特异的两条上游引物，两者在3
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端核苷酸不同，一个对野生型等位基因特异，另一个对突变型等位基因特异，在Taq DNA聚合酶作用下，与模板不完全匹配的上游引物将不能退火，不能生成PCR产物，而与模板匹配的引物体系则可扩增出产物，通过凝胶电泳或者qPCR就能很容易地分辨出扩增产物的有无，从而确定点突变型别。ARMS引物相对于Taqman探针和MGB探针而言，分辨率高，合成周期短，成本低。
[0005]为了高效快速地区分不同变异株，评估其传播能力及致病性，本专利技术采用ARMS
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qPCR技术开发一种用于鉴别SARS
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CoV
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2病毒S基因6种突变的试剂盒，目的是获得一种比测序法鉴别已知SARS
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CoV
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2变异株灵敏度更高，特异性更强的方法。
[0006]申请号为202210088334.3的专利使用基因芯片技术鉴别不同变异株，基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法。以待测样品的核酸为模板，用引物探针组中引物进行多重PCR扩增，所得扩增产物进行探针杂交，根据杂交结果判断待测样本属于新冠病毒具体类型。本专利技术方法为ARMS
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qPCR方法，通过上游引物3
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端序列的差异区分突变位点，用引物探针组进行多重扩增后即可通过Ct值判读进行变异株鉴别。申请号为202210088334.3的专利中基因本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于新型冠状病毒S基因6种突变位点检测的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包括检测S基因6个位点的特异性引物探针，所述S基因6个位点为69
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70del、E484K、K417N、N501Y、P681H、K417T位点；69
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70del位点特异性引物探针，正向引物序列为SEQ ID No.3；反向引物序列为SEQ ID No.6；探针序列为SEQ ID No.7；E484K位点特异性引物探针，正向引物序列为SEQ ID No.9；反向引物序列为SEQ ID No.13；探针序列为SEQ ID No.14；K417N位点特异性引物探针，正向引物序列为SEQ ID No.16；反向引物序列为SEQ ID No.17；探针序列为SEQ ID No.18；N501Y位点特异性引物探针，正向引物序列为SEQ ID No.19；反向引物序列为SEQ ID No.23；探针序列为SEQ ID No.26；P681H位点特异性引物探针，正向引物序列为SEQ ID No.28；反向引物序列为SEQ ID No.32；探针序列为SEQ ID No.35；K417T位点特异性引物探针，正向引物序列为SEQ ID No.37；反向引物序列为SEQ ID No.38；探针序列为SEQ ID No.39。2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，引物探针组合还包括ORF1ab基因的特异性引物探针，正向引物序列为SEQ ID No.40；反向引物序列为SEQ ID No.41；探针序列为SEQ ID No.42。3.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，引物探针组合还包括内标RNaseP基因的特异性引物探针，正向引物序列为SEQ ID No.43；反向向引物序列为SEQ ID No.44；探针序列为SEQ ID No.45。4.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，引物为ARMS引物，其3
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末端碱基与突变位点处碱基互补；特异性探针的两端分别带有荧光基团和淬灭基团；光基团选自FAM、HEX、VIC、TET、TAMRA、ROX、CY3...

【专利技术属性】
技术研发人员：贺华，张蓉，郭玉婉，黄青红，王珊，张少铎，袁威，刘中华，王国强，
申请(专利权)人：江苏硕世生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：