一种检测癌症中微卫星不稳定性的生物标志物组及其检测试剂盒和应用制造技术

本发明专利技术提供了一种检测癌症中微卫星不稳定性的生物标志物组及其检测试剂盒和应用，属于分子标记技术领域。本发明专利技术提供了用于判断微卫星(MS)状态的生物标志物组以及基于所述生物标志物组检测癌症中具有微卫星不稳定性(MSI)和/或错配修复(MMR)缺陷的试剂盒，用本发明专利技术提供的试剂盒检测人群的微卫星(MS)状态，具有检测结果准确度高、无需对照样本、检测成本低、时长短、操作简便、检测平台通用性高以及检测限低的特点，具有良好的临床应用价值。具有良好的临床应用价值。具有良好的临床应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种检测癌症中微卫星不稳定性的生物标志物组及其检测试剂盒和应用


[0001]本专利技术属于分子标记
，具体涉及一种检测癌症中微卫星不稳定性的生物标志物组及其检测试剂盒和应用。

技术介绍

[0002]结直肠癌(CRC)属危害严重的消化道恶性肿瘤。最近的指南，例如美国国立综合癌症网络(NCCN)结直肠癌临床实践指南：NCCN clinicalpractice guidelines in oncology(NCCN Guideline).Colon cancer,version 1.2021，以及中国临床肿瘤学会(CSCO)结直肠癌诊疗指南：Chinese Society ofClinical Oncology(CSCO)diagnosis andtreatment guidelines for colorectal cancer2020，推荐DNA错配修复(MMR)缺陷和/或MS状态的检测在所有结肠直肠癌(CRC)患者诊断中应用。然而，由于这些检测技术的复杂性，当下这些检测仍未得到充分利用。特别是，很难检测错配修复缺陷背后隐含的所有可能突变，尽管存在筛选它的替代方法，但目前的测定方法仍需要花费大量的操作时间，因此不适合成为诊断常规。
[0003]微卫星(Microsatellite,MS)是遍布于人类基因组中的短串联重复序列或简单重复序列，一般由1～6个核苷酸组成，呈串联重复排列，其重复次数为5～50次，人类基因组中广泛分布着约50万个短串联重复序列。当短串联重复序列进行复制时，碱基高度重复导致的“链滑”(Strand slippage)使复制错误几率远远高于正常序列，在健康人体中，短串联重复序列发生的错配可被DNA错配修复(Mismatch repair，MMR)机制及时修复，以确保复制过程的“保真性”，MMR对维持基因组稳定性以及遗传后代的精确性有着重要的作用。当DNA错配修复功能出现异常时，短串联重复序列的复制错误得不到纠正并不断累积，使得重复长度或碱基组成发生改变，会导致基因组发生10～100倍或更高的遗传突变频率，最终导致突变肿瘤的发生，称为微卫星不稳定(Microsatellite instability，MSI)。
[0004]MS状态检测影响许多癌症患者的存活率，在大量的结肠直肠癌(CRC)病例中，发现MMR基因中的缺陷对于肿瘤发生和疾病进展至关重要。例如，MMR基因MLH1的表观遗传沉默占结直肠癌(CRC)的约12％。另有2％～5％的病例是由MMR基因MLH1、MSH2、PMS2或MSH6之一中的常染色体显性遗传的功能丧失突变引起的。这种家族性癌症易感性病症被称为林奇综合征或遗传性非息肉性CRC(HNPCC)，并进一步导致胃癌和子宫内膜癌等的风险增加。MSI表型与基因组不稳定性、较高的突变率相关，并因此与不同的肿瘤行为和预后相关，与微卫星稳定的(microsatellite stable，MSS)肿瘤相比，高MSI(MSI
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H)肿瘤通常具有更好的预后和降低的转移可能性，具有错配修复缺陷的结肠直肠癌患者对抗PD
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1免疫疗法的应答特别好，早期的MSI CRC通常对基于5
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氟尿嘧啶的化学疗法没有应答。因为当MMR缺乏导致编码区中的MSI时，最常见的是产生启动子或移码突变，导致表达的缺乏，截短蛋白的表达，和/或含有新抗原的大量新序列的蛋白质。此外，显示内含子
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外显子边界区域中的MSI影响RNA剪接机制，并因此也干扰蛋白质翻译。因此，已经认识到，肿瘤中的MSI状态鉴定可能对治疗
结果产生巨大影响，并因此也对许多癌症患者的生活质量和预期寿命产生巨大影响。
[0005]目前临床上主要采用三种方法检测MSI/MMR：(1)免疫组织化学法(immunohistochemistry，IHC)检测MMR异常蛋白。IHC染色分析MMR蛋白表达是最常用的方法，它主要是检测肿瘤组织中MMR基因MLH1、MSH2、MSH6及PMS2的表达，阳性表达定位于胞核，若四个蛋白中任何一个或多个蛋白出现表达缺失，则会被判定为错配修复缺陷(dMMR)，即肿瘤可能为MSI
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L或MSI
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H，如果四个蛋白全部表达，则判断为错配修复功能完整(pMMR)，即MSS(Samowitz WS et al.2015)。此方法检测MSI相对较简单，成本较低。但可能出现错判情况，如样本异质性、病理医生的阅片标准不一致、肿瘤评分不一致等，都会降低该方法的准确性，假阴性率很高。(2)聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)检测MSI状态。该方法是采用多重荧光PCR与毛细管电泳相结合的方法，这也是当前公认的MSI检测的“金标准”，也是使用最广泛的方法。《CSCO结直肠癌诊疗指南2020版》建议采用美国癌症研究中心(NCI)推荐的2B3D Panel(BAT
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25、BAT
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26、D2S123、D5S346、D17S250，即Bethesda标准微卫星位点)和Promega Panel(BAT
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25、BAT
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26、NR
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21、NR
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24、MONO
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27)进行MSI检测。《NCCN遗传/家族高危评估指南：结直肠癌》建议MSI检测Panel可选择NCI/Bethesda版，也可选择Promega版。两个panel的判定标准也是一致的：5个位点中，MSI超过30％(5个位点中2个以上)为MSI
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H；少于30％(1个位点)考虑为微卫星低度不稳定(MSI
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L)，5个位点均稳定为MSS(Hegde M et al.2014)。虽然该方法能够更客观地评估功能性dMMR活性，但是对实验室条件要求高，不适于临床诊断，主要表现为：a、基因座在不同种族人群和不同肿瘤类型中的出现频率不同；b、在各个临床医生和研究实验室具有另外的标志物，因此导致标准化程度下降和可重复性差；c、检测过程中需要多次开管操作，易导致扩增产物的污染；d、需要同时检测待测样本和对照样本，提高了检测成本及工作量；e、检测流程长，仪器成本高，平台通用性较差，对操作人员水平要求高，难以实现自动化。(3)MSI二代测序(next generation sequencing，NGS)。该方法是采用目标区域NGS平台(即NGS panel)对肿瘤组织中多个MS位点进行检测，与PCR相比，NGS方法通量大，涉及基因范围广、灵敏度和特异性更高，NCCN结直肠癌临床实践指南指出，MSI检测可通过经验证的NGS panel进行，但主要针对于那些需要同时检测RAS/BRAF突变状态的转移性CRC患者。故该方法并不适用于单独检测MSI状态，增加了经济负担和浪费资源。此外，该方法对分析技术要求高，且检测周期长。
[0006]此外，检测癌症中微卫星不稳定性的关键在于，确定癌症中微卫星的不稳定性的生物标志物，尽本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测癌症中微卫星不稳定性的生物标志物组，其特征在于，包括映射至GRCh37/hg19人参考基因组的以下至少4种生物标志物：第一生物标志物包含9个连续A的同聚物重复，定位在人HDAC4基因中，起始位置为chr2:239,974,110；第二生物标志物为包含10个连续A的同聚物重复，定位在人RYR3基因中，起始位置为chr15:34,157,542；第三生物标志物为包含10个连续A的同聚物重复，定位在人BTBD7基因中，起始位置为chr14:93,708,031；第四生物标志物为包含8个连续A的同聚物重复，定位在人ACVR2A基因中，起始位置为chr2:148,683,686；第五生物标志物为包含11个连续A的同聚物重复，定位在人MRE11基因中，起始位置为chr11:94,212,931；第六生物标志物为包含11个连续A的同聚物重复，定位在人DIDO1基因中，起始位置为chr20:61,536,692；第七生物标志物为包含11个连续A的同聚物重复，定位在人ZNF169基因中，起始位置为chr9:97,063,726；第八生物标志物为包含11个连续A的同聚物重复，定位在人NDUFS1基因中，起始位置chr2:207,013,835。2.根据权利要求1所述检测癌症中微卫星不稳定性的生物标志物组，其特征在于，所述第一生物标志物、第二生物标志物、第三生物标志物、第四生物标志物、第五生物标志物、第六生物标志物、第七生物标志物、第八生物标志物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:8所示。3.根据权利要求1或2所述检测癌症中微卫星不稳定性的生物标志物组，其特征在于，包括5、6、7或8种所述生物标志物。4.根据权利要求1或2所述检测癌症中微卫星不稳定性的生物标志物组，其特征在于，所述生物标志物组包括第一生物标志物、第五生物标志物、第七生物标志物和第八生物标志物；所述生物标志物组包括第一生物标志物、第三生物标志物、第四生物标志物、第五生物标志物和第七生物标志物；所述生物标志物组包括第一生物标志物、第二生物标志物、第三生物标志物、第五生物标志物和第七生物标志...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆群，韩晓杰，焦海涛，孙震宏，沈伟强，
申请(专利权)人：浙江绍兴鼎晶生物医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：